高雄激素血症是由于雄激素代谢障碍所致的体内雄激素水平异常增高，由此而诱发了一系列的临床症状包括多毛、痤疮、排卵障碍以及一些代谢性疾病。导致女性高雄激素血症的疾病以多囊卵巢综合征最常见，约占70～80﹪。目前用于治疗高雄激素的药物有多种，但是都存在着不同程度的副作用。而研究表明这种以多囊卵巢综合征为代表的高雄激素血症存在雄激素合成的关键酶即17α羟化酶/17，20断裂酶功能的亢进，本研究将17 α羟化酶/17，20断裂酶作为治疗高雄激素血症的靶点，拟采用RNA干扰技术敲减GYP17基因的表达，部分抑制其表达产物17 α羟化酶/17，20断裂酶的生成，进一步证实该酶在高雄激素血症发病机制中所起的作用，并为抗雄激素治疗提供实验依据。本研究的内容包括于大鼠卵巢膜问质细胞的分离和鉴定，CYP17慢病毒干扰RNA有效性的筛选，以及高雄激素大鼠模型的构建，以便为今后的动物体内实验奠定基础。第一部分CYP17慢病毒干扰RNA的构建该部分工作是与上海吉凯生物有限公司合作完成，针对CYP17基因序列的不同靶点共设计了4条CYP17慢病毒干扰RNA和阴性对照。 第二部分大鼠卵巢膜间质细胞的分离鉴定以及CYP17慢病毒干扰RNA有效性的筛选目的在原代培养的大鼠卵巢膜间质细胞上对所构建的CYP17慢病毒干扰RNA进行有效性的筛选方法大鼠卵巢膜间质细胞的分离采用的是胶原酶消化加机械分离的方法，分离后再用Percoll密度梯度离心法纯化。通过细胞形态学、激素分泌情况、免疫荧光和RT-PCR的方法来鉴定所分离的细胞是否为膜间质细胞。若分离的细胞为膜间质细胞，则在此细胞上对所构建的CYP17慢病毒干扰RNA进行有效性的筛选，筛选通过流式细胞学技术观测病毒的感染效率，并采用荧光定量PCR、Western-Blot和激素测定的方法来判断CYP17慢病毒干扰RNA的基因敲减效果。 结果 原代培养的大鼠卵巢细胞形态呈纤维样，在浓度逐渐增加的LH刺激下细胞所分泌的雄稀二酮、睾酮、孕酮也呈逐渐增加的趋势，其中以LH浓度为10ng/ml至100ng/ml之间激素分泌增加最明显，免疫荧光证实在所分离细胞膜上有LHR的表达，并且RT-PCR也检测到分离细胞中有CYP17基因的表达，由此证实这种原代培养的大鼠卵巢细胞为膜间质细胞。用携带GFP的CYP17慢病毒干扰RNA感染膜间质细胞72小时后荧光镜下观测到GFP荧光表达，流式细胞学检测病毒平均感染效率为35.8﹪。荧光定量PCR．测定所构建的4条CYP17慢病毒干扰RNA的基因都有不同程度的敲减效应，其中以2＃CYP17慢病毒干扰RNA的基因敲减效率最高达90﹪。Westem-blot的结果也显示所构建的4条CYP17慢病毒干扰RNA均有敲减效应。激素测定结果提示4条CYP17慢病毒干扰RNA对雄稀二酮的分泌有不同程度的抑制作用，但是这种抑制作用比较弱平均仅为10﹪，因此还需通过改进实验方法进一步确认其生物学效应。 结论1、通过细胞形态学、激素分泌情况、免疫荧光和RT-PCR的结果证实所分离的细胞为大鼠卵巢膜间质细胞。 2、所构建的4条CYP17慢病毒干扰RNA对CYP17的基因敲减均有效，其中以2＃CYP17慢病毒干扰RNA的基因效率最高。 第三部分高雄激素模型的建立目的建立一个以17 α羟化酶/17，20断裂酶功能亢进为特征的高雄激素大鼠模型，为下一步体内实验提供动物模型。 方法 采用胰岛素和HCG联合用药持续皮下注射85日龄的SD大鼠23天建立动物模型，在用药结束后观察大鼠的体重变化，并测定大鼠血清睾酮、雄稀二酮、17羟孕酮和脱氢表雄酮硫酸盐的水平观察用药后大鼠激素水平的变化，同时解剖大鼠取其双侧卵巢称重，HE染色观察其组织形态学变化并进行囊性卵泡计数。 结果 用药结束后观测用药组和对照组大鼠体重变化分别为53.9±5.6g和31.4±6.4g，p<0.05。激素测定用药组和对照组大鼠孕酮、17羟孕酮、雄稀二酮、睾酮和脱氢表雄酮硫酸盐水平分别为108.04±24.83 ng/ml、10.79±1.78ng/ml、0.8±0.16 ng/ml、4.98±0.5 nmol/ml、0.0750.0082 ng/ml和10.72±8.41、2.92±0.32 ng/ml、0.19±0.086ng/ml、3.3±0.3 nmol/ml、0.13±0.09 ng/ml，其中用药组大鼠孕酮、17羟孕酮、雄稀二酮、睾酮水平均高于正常对照组p<0.05，而脱氢表雄酮硫酸盐无统计学差异。