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2005年5-7月,我国青海湖及周边区域首次出现大量候鸟死于H5N1亚型高致病性禽流感。由于部分候鸟具有在水环境中生活的习性,所以水体成为禽流感病毒重要的高危载体。为了了解青藏高原禽流感发生及传播模式,本研究建立了一种硝酸纤维素膜过滤的方法检测水环境中的禽流感病毒,应用此方法从青海湖周边水环境样品中分离出一株高致病性H5N1亚型流感病毒,并对其致病性、生物学特性、遗传变异等进行了研究。从而为揭示流感病毒引起的病理学变化规律及其传播机制提供科学依据。用硝酸纤维素膜过滤法对自来水和生活污水中的禽流感病毒进行浓缩,回收率分别为96.14%和93.44%,二者无显著差异。实验中对禽流感病毒做10倍系列稀释再回收,回收率随病毒浓度变化不明显,应用本方法均可以有效起到回收病毒的作用。在自来水中,当病毒的投放浓度达96PFU/L以上时,回收率均在78.13%以上。在污水中,当投放浓度达到96PFU/L时,回收率为47.92%,比自来水中的回收率有所下降。本试验比较了甘氨酸缓冲液、牛肉膏溶液、磷酸缓冲液3种最为常用的洗脱液在不同pH条件下(7、9.5、11)的最佳洗脱效果。试验结果表明,当pH9.5,O.1mol/L甘氨酸缓冲液作为洗脱液时的病毒回收率最高。用本方法对青海地区水样品进行分离浓缩,结果分离出一株高致病性H5N1流感病毒。从致病性试验可知,此分离株流感病毒感染鸭只后24h,在鸭的肺、肾、肝、脾、脑和胸肌中可检测到病毒。感染后36h时机体内病毒含毒最高;到60h时机体含毒量下降,在肝、脾、肾检测不到病毒的存在,而在肺、脑、胸肌病毒含量仍基本维持峰值,小鼠感染流感病毒后变化趋势和鸭只感染后的变化趋势几乎一致,唯一不同的是在感染后60h在肌肉中检测不到流感病毒,说明流感病毒具有组织嗜性。用无特定病原体(SPF)鸡胚增殖病毒,提取鸡胚尿囊液中的病毒总RNA,设计禽流感病毒的8个基因的引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分别扩增分离株的8个基因片段的全序列cDNA,将其分别克隆在PMD18-T载体上进行鉴定和序列测定。结果表明扩增的8个基因片段均包含H5N1流感病毒相应的完整开放阅读框架。用DNAStar分析软件对本分离株与11株禽流感病毒的基因组的8个基因序列进行分子遗传演化分析,结果表明本分离株的HA基因与欧亚种系分离株Shandong/2003同源性为98.6%,且在同一进化分支上;而与北美代表株Ireland/1983同源性为86%,且在相距较远的进化分支上,此比较结果表明本分离株起源于欧亚种系。本分离株HA裂解位点的氨基酸序列为PQRERRRKKR,且连续多于5个碱性氨基酸,说明其为高致病性流感病毒株。而其它7个基因的核苷酸同源性和分子演化分析显示,本分离株各基因与Shangdong/03株的相应基因的同源性均在95.7%以上,说明此两株的亲缘关系较近。因此,可以推测本试验分离株Qinghai/2007(H5N1)很可能是由03年山东猪流感毒株变异演化而来。