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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的急性传染病。该病毒分为欧洲型和美洲型两种基因型。2006年,我国爆发高致病性PRRS,给养猪产业带来极大的冲击。NSP2是PRRSV中分子量最大、变异最大的蛋白,常作为PRRSV监控的靶点,同时其在PRRSV的复制、免疫、引发宿主细胞自噬和凋亡中发挥着重要功能。本研究分离鉴定了1株2012年黑龙江省的美洲型HP-PRRSV,并命名为HH12株。应用RT-PCR技术成功克隆HH12株和实验室已鉴定的2株HP-PRRSV(Jilin TN1株和Jilin TN2株)的NSP2全长基因,测序结果3个分离株NSP2全长均为2850 bp。将所克隆序列与美洲经典型PRRSV NSP2比对,发现3个分离株的NSP2基因均存在HP-PRRSV特征性的30个氨基酸缺失。遗传进化分析表明,3个分离株与HP-PRRSV代表株JXA1 NSP2基因序列相似性为98.5%~98.7%,且在遗传进化树中属于JXA1株为代表的亚群,并与HB0701株处于同一分支。以Jilin TN1株为研究对象,设计并合成能够扩增删除了部分疏水区的NSP2片段的特异性引物,应用RT-PCR对其进行亚克隆,构建p GEX 6p-NSP2重组质粒,转化至E.coli Rostta感受态细胞中通过原核表达重组NSP2蛋白,SDS-PAGE分析其大小约131.5 ku,经Western-blot鉴定纯化复性后的重组蛋白能够与PRRSV阳性血清反应。以该蛋白为免疫原,免疫新西兰兔制备抗血清,4免后检测其效价达1:215,且与HP-PRRSV及经典型PRRSV反应效价可达1:211。western-blot结果表明所获抗血清特异性较高。IFA结果显示该多抗能够检测到Marc-145细胞上繁殖的HP-PRRSV和经典型PRRSV,且能够与p VAX-NSP2转染BHK-21细胞瞬时表达的NSP2蛋白反应。Real-time PCR结果显示该抗体对HP-PRRSV和经典型PRRSV具有较好的抑制效果,对两者的最高抑制率分别为76.0%和58.6%。以上结果说明所制备的多抗生物学活性良好,为NSP2的深入研究提供很重要的基础。以Gen Bank数据库中包括本研究克隆的624条美洲型PRRSV NSP2序列为研究对象,应用RDP4.2软件对NSP2重组事件进行检测,同时应用SIMPLOT软件和MEGA5.2软件从遗传相似性和遗传进化两个角度对重组事件进行验证和分析。检测结果发现11个重组事件,共包含37个重组毒株,占总分析毒株的5.9%(37/624),而本研究3个分离株的NSP2基因未发现重组。美洲变异型、传统型和经典型毒株均发现了重组:其中传统型有3株,经典型有7株,变异型有27株。这些重组事件中不仅存在7个型内重组,还发现了4个型间重组,检测到的型间重组毒株主要由美洲变异型与传统型或经典型通过重组产生。遗传进化分析表明,发生型间重组的毒株具有独特的进化地位。以上结果提示,在美洲型PRRSV的进化过程中NSP2基因片段有重组发生,变异型毒株的出现加快了PRRSV的进化速度并且使其变异情况更加复杂。同时,基因重组可能是PRRSV发生型间转换、甚至产生新基因型的进化基础,这可能会造成新型PRRSV的爆发,这一结果提示需针对PRRSV的变异提出新的防控措施。