脑胶质瘤是神经系统最常见的肿瘤,可发生于中枢神经系统的任何部位,是临床上疗效较差的肿瘤之一。脑胶质瘤因其粘附性强、迁移、侵袭快速的恶性生长方式,严重影响了预后。　　 青蒿素是我国药学工作者1971年从菊科植物黄花叶中提取分离到的一种具有过氧基因的倍半萜内酯化合物,具有很强的抗疟活性。近年来研究发现青篙素及其衍生物具有明显的抗肿瘤作用和逆转肿瘤的多重耐药作用,蒿甲醚(Artemether)是青蒿素的重要衍生物之一,作为抗疟药物广泛应用于临床,同时具有抗肿瘤作用。Artemether可透过血脑屏障进入脑组织,在体内脑组织分布最高,为青蒿素的六倍。大量研究认为其抗肿瘤作用可能为抑制增殖,诱导凋亡,抑制血管生成。　　 血管生成对实体瘤的生长和转移至关重要,肿瘤发生转移前血管生成明显增强,肿瘤血管生成的速度和密集度与肿瘤的迁移、侵袭能力呈正相关。而血管内皮细胞粘附分子1(VCAM1)等粘附分子在肿瘤的血管生成过程中起着很重要的作用。研究证明在胶质瘤中VCAM1高表达,同时,应用抗VCAM1的抗体作用C6胶质瘤移植Vista大鼠,明显抑制了肿瘤生长,延长了生存时间。通过阻止肿瘤新生血管形成,达到抑制肿瘤生长与恶化的目的已成为人们临床抗肿瘤药物的靶点之一。　　 从原位的增殖性肿瘤到侵袭转移癌的演进过程中,肿瘤细胞必须具备降解细胞外基质的能力。细胞外基质的降解主要依靠蛋白水解酶。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)是四类蛋白水解酶:丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶中较为重要的一类,目前已发现了14种,它们几乎能降解细胞外基质的所有成分,因而成为近年来肿瘤侵袭和转移研究的热点。研究证明基质金属蛋白酶家族中的MMP2和MMP9在胶质瘤细胞中均高表达,并在肿瘤的迁移和侵袭过程中起到重要作用,因此作为抑制胶质瘤侵袭和转移的靶点得到广泛关注。PI3K/Akt信号通路在肿瘤的增殖、凋亡、血管发生以及细胞运动中发挥着重要作用,研究证明PI3K/Akt信号通路与调节MMP蛋白的表达。Artemether是否通过PI3K/Akt信号通路抑制MMP2和MMP9达到抑制胶质瘤的效果,目前尚未见报道。　　 本论文首先研究Artemether对人脑胶质瘤U87细胞的作用效果与机制,在此基础上,应用RNA干扰技术沉默VCAM1的表达,稳定转染U87细胞,研究Artemether联合RNA干扰沉默VCAM1对U87细胞迁移、侵袭、凋亡的作用效果和相关机制,旨在为人脑胶质瘤的治疗提供新的实验依据。　　 实验材料和方法：　　 一、实验材料　　 (一)实验细胞株　　 人胶质瘤U87细胞株购自于南京凯基生物科技有限公司。　　 (二)主要试剂　　 蒿甲醚(云南昆明制药厂),MTT,DMSO(美国Sigma公司),DMEM/F-12培养基(美国HyClone公司),胎牛血清(天津灏洋生物科技有限公司),AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技有限公司),羊抗Akt1/2多克隆抗体,兔抗P-Akt1/2/3(Ser473)多克隆抗体,兔抗MMP2多克隆抗体,羊抗MMP9多克隆抗体,兔抗VCAM1多克隆抗体,小鼠抗β-actin单克隆抗体,增强化学发光法试剂盒(美国SantaCruz公司),兔抗山羊HRP标记的IgG二抗,山羊抗兔HRP标记的IgG二抗,山羊抗小鼠HRP标记的IgG二抗(北京中山生物技术公司)。　　 (三)主要仪器　　 细胞培养箱(美国Formascientific公司);超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);倒置显微镜(日本TMS公司);紫外-可见光分光光度计(日本岛津公司);BDFACSCalibur流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司);超声粉碎机(德国Dr.Hielscher公司);台式低温超速离心机(德国Sigma公司);聚丙烯酰胺凝胶电泳装置(美国Bio-Rad公司);转印仪(北京市六一仪器厂);Las3000成像系统(日本FUJIFILM公司);凝胶成像分析软件(江苏捷达科技有限公司);电子分析天平(德国Sartorius公司);-80℃超低温冰箱(日本SANYO公司);恒温震荡水浴(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)。　　 二、实验方法　　 (一)细胞培养　　 (二)实验分组　　 1、Artemether对U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响　　 (1)0μmol/l组:U87细胞+正常培养液　　 (2)150μmol/l组:U87细胞+Artemether(150μmol/l)　　 (3)300μmol/l组:U87细胞+Artemether(300μmol/l)　　 (4)600μmol/l组:U87细胞+Artemether(600μmol/l)　　 2、验证shRNA-VCAM1的沉默效率　　 (1)Blank:U87细胞　　 (2)NC:U87细胞转染空白质粒　　 (3)shRNA-VCAM1:U87细胞转染沉默VCAM1质粒　　 3、Artemether与shRNA-VCAM1联合应用对U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响　　 (1)Control组:U87细胞　　 (2)Artemether组:U87细胞+Artemether(300μmol/l)　　 (3)shRNA-VCAM1组:U87细胞转染沉默VCAM1质粒　　 (4)shRNA-VCAM1+Artemether组:转染沉默VCAM1质粒的U87细胞+Artemether(3001μmol/l)　　 (三)细胞的稳定转染及扩大培养　　 (四)MTT法测定细胞增殖活性。　　 (五)划痕试验观察细胞迁移能力。　　 (六)Transwell侵袭实验测定细胞侵袭能力。　　 (七)细胞凋亡AnnexinV-FITC/PI检测　　 (八)WesternBlot方法检测P-Akt,MMP2,MMP9的变化　　 (九)统计学处理　　 所有数值以均数±标准差(-X±SD)表示,采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析,两两比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析(Bonferroni检验),P＜0.05为差异有统计学意义。　　 实验结果：　　 一、Artemether抑制U87细胞的增殖　　 不同浓度的Artemether作用于U87细胞,Artemether以剂量依赖方式抑制细胞生长:与0μmol/l相比,作用时间为48小时及72小时的400μmol/l,600μmol/l,800μmol/l,1000μmol/l的Artemether显著抑制细胞生长,作用时间为24小时的IC50为948.47±10.2pmol/l,48小时的IC50为354.81±13.8μmol/l,72小时的IC50为275.42±9.5μmol/l。Artemether作用48h后显著抑制细胞生长,而72h与48h相比没有明显变化。因此,48h作为最长给药时间,进行后续试验。　　 二、Artemether抑制U87细胞的迁移能力　　 浓度分别为0μmol/l,150μmol/l,300μmol/l,600μmol/l的Artemether作用于U87细胞,结果发现随着Artemether浓度升高,U87细胞的迁移能力逐渐降低。　　 三、Artemether抑制U87细胞的侵袭能力　　 浓度分别为0μmol/l,150μmol/l,300μmol/l,600μmol/l的Artemether作用于U87细胞48h后,各组穿过8μm含BD基质胶的Transwell小室的细胞个数分别是78.5±3.5个,71.7±1.2个,54.7±1.2个,22.3±2.1个。与0μmol/l组相比150μmol/l、300μmol/l和600μmol/l的Artemether分别使U87细胞的侵袭能力显著降低(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01)。　　 四、Artemether促进U87细胞的凋亡　　 浓度分别为0μmol/l,150μmol/l,300μmol/l,600μmol/l的Artemether作用于U87细胞48h后,应用AnnexinV-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡。各组凋亡率分别为4.77±0.62%,9.28±0.71%,15.11±1.05%,22.70±0.92%。与0μmol/l组相比150μmol/l,300μmol/l和600μmol/l的Artemether显著促进U87细胞的凋亡(P＜0.01)。　　 五、Artemether降低U87细胞的MMP2、MMP9蛋白表达　　 不同浓度的Artemether作用U87细胞48h后,WesternBlot结果显示,与0μmol/l组相比,150μmol/l,300μmol/l和600μmol/l的Artemether分别显著降低MMP2、MMP9蛋白表达水平(P＜0.01)。　　 六、Artemether降低U87细胞p-Akt/Akt的蛋白表达　　 不同浓度的Artemether作用U87细胞48h后,WesternBlot结果显示,与0μmol/l组相比,300μmol/l和600μmol/l组分别显著降低p-Akt/Akt蛋白表达水平(P＜0.05,P＜0.01)。　　 七、Artemether降低U87细胞VCAM1的蛋白表达　　 不同浓度的Artemether作用U87细胞48h后,WesternBlot结果显示,与0μmol/l组相比,300μmol/l、600μmol/l的Artemether分别显著降低VCAM1蛋白表达水平(p＜0.05)。　　 八、验证shRNA-VCAM1的沉默效率　　 应用RNA干扰沉默VCAM1的U87细胞,稳定转染后,WesternBlot结果显示,与blank组相比,VCAM1的表达显著降低,NC对照组无明显变化,沉默效率达到70%。　　 九、Artemether与shRNA-VCAM1联合应用抑制U87细胞的迁移　　 浓度为300μmol/l的Artemether与shRNA-VCAM1联合作用于U87细胞,细胞划痕试验观察对U87细胞迁移能力变化,Artemether组、shRNA-VCAM1组和shRNA-VCAMl+Artemether组分别抑制了U87细胞的迁移能力,shRNA-VCAMl+Artemether组效果更明显。　　 十、Artemether与shRNA-VCAM1联合应用抑制U87细胞的侵袭　　 浓度为300μmol/l的Artemether与shRNA-VCAM1联合作用于U87细胞,Transwell侵袭实验检测U87细胞侵袭能力变化。Control组穿过Transwell小室的细胞个数为79.67±2.08个,Artemether组为57±2.65个,shRNA-VCAM1组为46±1个,shRNA-VCAM1+Artemether组为18.33±1.53个。与Control组相比,Artemether组、shRNA-VCAM1组和shRNA-VCAM1+Artemether组分别使U87细胞侵袭力降低,与Artemether组或shRNA-VCAM1组相比,shRNA-VCAM1+Artemether组分别显著降低了U87细胞的侵袭能力(P＜0.01)。　　 十一、Artemether与shRNA-VCAM1联合应用促进U87细胞凋亡　　 浓度为300μmol/l的Artemether与shRNA-VCAM1联合作用于U87细胞,AnnexinV-FITC/PI染色方法检测U87细胞凋亡情况,U87组凋亡率为4.89±0.58%,Artemether组为17.66±1.12%,shRNA-VCAM1组为10.97±0.62%,shRNA-VCAM1+Artemether组为40.04±1.11%。与Control组相比,Artemether组,shRNA-vCAM1组,shRNA-VCAM1+Artemether组均显著促进U87细胞的凋亡,而与Artemether组或shRNA-VCAM1组相比,shRNA-VCAM1+Artemether组显著促进了U87细胞的凋亡(P＜0.01)。　　 十二、Artemether与shRNA-VCAM1联合应用降低U87细胞MMP2、MMP9的蛋白表达　　 Artemether联合沉默VCAM1共同作用U87细胞48h后,WesternBlot结果显示,与Control组相比,Artemether组,shRNA-VCAM1组,shRNA-VCAM1+Artemether组均显著降低MMP2、MMP9蛋白的表达(P＜0.01),与Artemether组或shRNA-VCAM1组相比,shRNA-VCAM1+Artemether组分别显著降低了MMP2、MMP9蛋白的表达(P＜0.05)。　　 十三、Artemether与shRNA-VCAM1联合应用降低U87细胞p-Akt/Akt蛋白表达　　 联合应用Artemether和shRNA-VCAM1,作用U87细胞48h后,应用WesternBlot方法检测p-Akt/Akt蛋白的表达。与Control组相比,Artemether组、shRNA-VCAM1+Artemether组分别显著降低p-Akt/Akt蛋白表达(P＜0.01)。与Control组相比,shRNA-VCAM1组对p-Akt/Akt蛋白表达未有统计学意义的影响(P＞0.05)。与Artemether组相比,shRNA-VCAM1+Artemether组显著降低了p-Akt/Akt蛋白表达(P＜0.05)。与shRNA-VCAMl组相比,shRNA-VCAMl+Artemether组显著降低了p-Akt/Akt蛋白表达(P＜0.01)。　　 结论：　　 1、Artemether以剂量依赖方式显著抑制人脑胶质瘤U87细胞的迁移、侵袭,并促进U87细胞的凋亡,上述作用与Arternether降低VCAM1的表达以及抑制MMP2、MMP9和p-Akt/Akt的表达相关。　　 2、应用RNA干扰沉默VCAM1显著抑制U87细胞的迁移和侵袭。　　 3、与Artemether或shRNA-VCAM1单独应用相比,Artemether联合shRNA-VCAM1在抑制U87细胞迁移、侵袭,以及促进U87细胞的凋亡作用上存在协同作用,此作用与抑制MMP2、MMP9和p-Akt/Akt的表达相关。