白细胞介素12（IL-12）是由B细胞、单核巨噬细胞等抗原递呈细胞分泌的一种异二聚体细胞因子。研究表明，IL-12能促进NK细胞和T细胞的增殖、活化及细胞毒作用；促进巨噬细胞的活化和多种细胞因子的产生；调节Th0细胞向Th1细胞分化发育，增强细胞免疫功能。上述生物学功能提示，IL-12在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。这在多种肿瘤包括B16F10黑色素瘤、Renca肾细胞癌、Lewis肉瘤等模型中已得到证实。然而，体内直接注射IL-12蛋白所致的毒副作用限制了其临床应用。自Wolff等（1990年）提出基因治疗的新方法——裸DNA（naked DNA）直接注射以来，为解决该问题提供了新思路。质粒DNA注入体内可在局部细胞表达分泌，使局部组织积聚高浓度的IL-12，改善肿瘤的微环境，激发抗肿瘤免疫应答，且血清中的IL-12较低，避免全身性的毒副作用。实验目的 利用双CMV启动子构建小鼠IL-12（mIL-12）双亚基共表达的真核表达质粒pCmIL-12。并将pCmIL-12在体内外进行表达，观察其在体外能否表达有生物学活性的mIL-12以及体内增强NK细胞活性的潜能，为进行mIL-12肿瘤基因治疗研究奠定基础。实验方法 将 mIL一2p35和 p40全长编码 cDNA分别从 pBluescript SK／mp35和pBluescript SK／mp40质粒中切下，分别构建到 pcDNA3．l（＋）（以下均简称为pCDNA3且）载体中，即 pC35和 pC40。再把 p35的表达单元（CMV－p35－BGHPA）从pC35中切下，插人pC40载体中，使两个目的基因均受各自的启动子CMV控制，构建成mIL－12双亚基共表达质粒pCmIL－12。 将 pCmILJ 2体外转染 COS－7细胞，收集培养上清，检测其中 mIL－12的含量以及对小鼠NK细胞活性的影响。并进一步在小鼠皮内注射该质粒，观察其在体内对小鼠NK细胞活性的影响。实验结果 对 pCmIL－12进行酶切鉴定和序列分析，结果与预期的一致。 pCmlL－12、pC35＋pC40、pcDNA3l三组质粒分别转染COS－7细胞进行瞬时表达。表达上清与小鼠脾细胞共孵育后，前两组的NK细胞活性分别达42．9土3．78％和28．6士3．820，与pCDNA3．l表达上清（ZI．4土3．89％）相比均有显著差别（P＜0．05）。而且 pC＜IL－12表达上清的活性明显强于 pC35和 pC40同时转染的上清（P＜0刀5）。对表达上清中的ml＊－12中7o）的测定结果显示：扯ml＊－12的表达上清中含mIL－12蛋白270－350pg／ml，而pcDAN3＊的表达上清中不含ffiILIZ。 三组不同的质粒分别作小鼠皮内注射后发现，注射PCmIL12的小鼠NK细胞活性高达52石士5石％，而皮内注射pC35＋pC40及pCDNA3．l’J’鼠NK活性分别为20刀士8．8％及18．4士5．4％，前一组和后两组间有显著差异（P＜0刀1）。实验结论 1、我们构建的pCmIL刁 质粒在体外能够表达mIL－12，其表达上清能明显增强NK细胞活性，而且作用强于pC35和 pC40同时转染细胞的表达上清。 2、pCmIL1 质粒在小鼠体内表达后亦能显著增强NK细胞的活性，而且其活性高于体外的表达上清。pC3s和 pC40在体内却不能表达有活性的 IL＊。 二 3小CmIL1 质粒在体内外均能表达有生物学活性的mIL1，可用于几＊基因治疗的研究。