胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,胃癌诊断主要依赖内镜检查、组织活检和血液肿瘤标志物检测等。胃镜活检是一项有创检查,目前临床上使用的胃癌标志物的灵敏度和特异度也不高,因此寻找胃癌新型标志物将有可能提高胃癌的诊断水平。由于环状RNA（circular RNA,circRNA）具有结构稳定和广泛存在于各种体液中的特点,探索与胃癌相关的circRNA作为标志物,为胃癌的诊断、预后和有效治疗创造新可能。本实验以hsa＿circ＿0061276为研究对象,使用逆转录-微滴式数字PCR（reverse transcription-droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR）Eva Green染料法,对血浆标本中hsa＿circ＿0061276的拷贝数进行定量检测,分析其作为胃癌标志物的诊断价值;并通过细胞实验探究hsa＿circ＿0061276在胃癌发生中的可能作用。研究方法1.设计hsa＿circ＿0061276特异性引物,经测序验证。放线菌素D处理、重复性实验和标本贮存条件实验,验证血液hsa＿circ＿0061276的稳定性。2.利用RT-ddPCR Eva Green染料法检测健康人,以及胃炎、胃溃疡、胃癌前病变、早期胃癌和进展期胃癌患者血浆中hsa＿circ＿0061276的拷贝数,分析其在胃癌诊断中的价值。3.首先检测hsa＿circ＿0061276在胃癌细胞中表达情况,然后构建hsa＿circ＿0061276上调和下调质粒,转染效果验证;最后分析hsa＿circ＿0061276对胃癌细胞增殖、迁移和细胞周期等的影响。4.核质分离实验分析hsa＿circ＿0061276在细胞内定位情况。使用circMir软件预测hsa＿circ＿0061276的微小RNA（micro RNA,miRNA）海绵作用。实验结果1.琼脂糖凝胶电泳结果及TA克隆测序均证实扩增产物与预期相符。放线菌素D实验说明hsa＿circ＿0061276的半衰期比其亲本基因核受体相互作用蛋白1（nuclear rector interacting protein 1,NRIP1）mRNA的半衰期更长;重复性实验和标本贮存条件实验说明血浆hsa＿circ＿0061276稳定性好。2.利用RT-ddPCR成功在人血浆中检测到hsa＿circ＿0061276的拷贝数。随着病程进展,血浆hsa＿circ＿0061276拷贝数有下降趋势。组别相互比较,发现健康组与进展期胃癌组比较的结果最佳,受试者工作特征曲线下面积为0.7380。3.转染实验结果显示,hsa＿circ＿0061276过表达和干扰质粒均有效。过表达hsa＿circ＿0061276后,细胞计数试剂-8和集落形成结果显示,胃癌细胞的增殖能力均被抑制,迁移能力也有下降。当下调hsa＿circ＿0061276表达时,胃癌细胞的增殖、迁移能力均有不同程度的加强。流式细胞仪检测过表达和下调hsa＿circ＿0061276后胃癌细胞的细胞周期,结果发现过表达后胃癌细胞被阻滞在G1期,下调后胃癌细胞却在S期增加。4.在明确hsa＿circ＿0061276定位于细胞质中和预测出hsa＿circ＿0061276具有miRNA海绵功能的基础上,筛选出3个在胃癌中高表达的miRNA（hsa-miR-6504-5p、hsa-miR-7705和hsa-miR-7974）;经转染它们的类似物,下调了胃癌细胞中hsa＿circ＿0061276的表达。双荧光素酶报告基因实验和CCK-8增殖实验说明hsa＿circ＿0061276具有miRNA海绵功能,且hsa-miR-7705可能参与抑制hsa＿circ＿0061276的表达。研究结论1.hsa＿circ＿0061276有希望成为胃癌新型标志物,对于胃癌诊断具有一定的价值。2.细胞水平实验说明hsa＿circ＿0061276可能通过充当miRNA海绵发挥抑癌作用。