【摘 要】
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该文旨在将解毒酶酯酶B1基因融合高效表达,为其实际应用创造条件.该文将从抗性库蚊(Culex pipiens)中分离出的解毒酶基因和硫氧还蛋白融合表达载体pThioHisA用限制性内切酶Ec
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该文旨在将解毒酶酯酶B1基因融合高效表达,为其实际应用创造条件.该文将从抗性库蚊(Culex pipiens)中分离出的解毒酶基因和硫氧还蛋白融合表达载体pThioHisA用限制性内切酶EcoRI消化,用低熔点胶回收消化片段并纯化,纯化后的载体脱磷,在T<,4>DNA连接酶作用下将二者进行体外连接,将连接产物转化大肠杆菌DH5α,在100μg/L氨苄青霉素平板上筛选Amp转化子,将重组质粒分别经BgιⅡ、BamHI单酶切,电泳分析获得酯酶基因插入方向正确的融合表达质粒,命名为pThioHisA-B1.以α-NA为底物对所构建工程菌进行酯酶活性测定,结果表明该工程菌能高效降解α-NA,具有较强的酯酶活性,融合伴侣硫氧还蛋白促进了酯酶B1的正确折叠,形成了天然的蛋白质构象.该研究将工程菌以2.5﹪海藻酸钠、3﹪CaCl<,2>进行包埋固定,以α-NA为底物测定固定化工程菌的酯酶活性,结果表明工程菌固定化后,酶活虽有所降低,但仍有一定的解毒能力.将最适条件下诱导的工程菌发酵液离心,收集菌体,加样品提取液超声、冻融法将菌体破壁,4℃,10000rpm离心收集上清液,获得粗提蛋白.将粗提蛋白经硫酸铵分级盐析,DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析,Sephadex G-150分子筛层析后,用聚乙二醇包埋浓缩,SDS-PAGE电泳检测提取物纯度,表明TrxA-EstB1融合蛋白已被提纯.对该融合蛋白进行酶活性测定表明它具有酯酶B1的解毒活性,最适反应条件为40℃,pH7.5.
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