细菌在面对复杂的生存环境会通过不同的方式进行存活,形成生物被膜(Bacterial biofilm,BF)则是细菌在自然界中普遍存在的生存方式之一。由于BF结构的特殊性,病原微生物形成的BF易引起临床医疗上一系列相关的慢性或顽固性微生物感染。此外在食品生产加工过程中,一些主要食源性致病菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等均能在食品表面或食品生产设备上形成BF,从而引发食品腐败以及感染食源性疾病等一系列食品安全问题,消除或抑制BF形成是医疗和食品行业面临的一个巨大挑战。由于BF形成经历“运动-静止-运动”复杂动态过程离不开鞭毛介导的运动和细菌双组分信号系统(two-component system,TCS)的调控这两大因素。因此,本课题围绕细菌BF形成、运动和TCS系统三方面进行机制调控研究,寻找有效消除BF形成的靶点,在后续开发抗微生物感染抑制剂方面具有十分重要的现实意义。本文以Escherichia coli MG1655为实验对象,首先利用CRISPR/Cas9编辑技术和λ-Red重组系统相结合敲除QseBC系统关键基因,构建Δqse C和Δqse BC菌株。其次,利用结晶紫染色法(CV)、激光共聚焦显微镜(CLSM)、电子扫描显微镜(SEM)对野生型(WT)和突变菌株在不同时间条件下(6、12、24和36h)形成的BF定量和结构定性分析。同时,对WT和突变菌株在不同琼脂浓度培养基(0.1-0.6%)和不同时间(6、12、24、36、48和72h)的条件下进行细菌运动性分析,以及利用Bioscreen全自动微生物生长曲线自动分析仪测定其生长曲线及分析生长动力学参数。最后,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测WT和突变菌株之间引起表型差异的相关基因表达。本文的主要研究内容及研究结果如下:1.利用CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌QseBC系统关键基因CRISPR/Cas9系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein9)是一种获得性免疫防御机制,可以利用本身特殊免疫功能介导基因进行编辑,具有强针对性、方便和高效率的特点。在之前本实验室已经获得Δqse B突变株的基础上,本课题继续采用CRISPR/Cas9技术与λ-Red重组系统偶联的双质粒系统(p Cas/p Target)的方法对大肠杆菌qse C、qse BC基因进行敲除。对转化子菌落PCR鉴定以及测序验证结果进行分析得出,在修复模板和含有20bp识别靶序列质粒构建成功的基础上,通过菌落PCR鉴定和测序验证qse C和qse BC基因敲除成功。2.QseBC双组分系统影响大肠杆菌运动和生物被膜形成的表型变化接下来为了进一步验证qse C和qse B基因在BF形成、运动性方面的功能。在测定BF形成方面,首先采用结晶紫染色方法对WT和突变株BF形成进行定量分析。结果表明,大肠杆菌BF在24h形成量最多;Δqse C造成早期生物被膜形成量的增加;Δqse B不影响BF形成量变化;Δqse BC在12h的BF形成量增加,而在前期、成熟期及分散期的BF都没有显著差异。随后利用激光共聚焦显微镜结合ISA软件对WT和突变株的BF结构进行定性分析,结果显示Δqse C的BF结构参数ADD、TE值增加,说明早期BF间菌落形成更加密集。随后利用SEM观察WT和突变株形成的早期BF结构,结果进一步表明与WT相比Δqse C早期BF形成更加密集且菌体长度显著变长。为了进一步探究qse C缺失引起BF形成差异性的影响因素,则从运动和生长方面进行分析。结果表明,QseBC系统参与调控大肠杆菌游泳运动。与WT相比,Δqse C运动显著降低约0.55倍,Δqse B运动显著增加约1.98倍,Δqse BC运动没有差异。另外通过对WT和突变株的生长动力学参数分析发现,与WT相比Δqse C最大生长速率降低。总体而言,Δqse C促进早期BF形成,抑制游泳运动;Δqse B不影响BF形成,但促进游泳运动;Δqse BC不影响BF形成和运动性。由此说明QseBC系统与运动和BF形成密切相关,且细菌运动和BF形成并不存在严格的负调控规律。3.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测QseBC系统相关基因表达为了进一步探究Δqse C、Δqse B和Δqse BC在BF形成和游泳运动产生差异的原因,利用qRT-PCR检测鞭毛、菌毛、DNA复制、TCS系统基因的相对表达量。结果表明,在ΔqseC菌株中qseB表达量增加约196倍,说明当外界信号刺激QseBC系统,由于缺乏膜蛋白Qse C接收信号进行转化,同时胞内同源蛋白Qse B一直处于“备战”状态,导致Qse B过表达。另外,结合表型结果可得出Qse B蛋白与细菌运动具有负调控关系:当qse B过表达,抑制运动;Δqse B时,促进运动。另外Δqse C、Δqse BC鞭毛基因表达量增加,却没有促进运动,说明调控运动和生物被膜形成的关键因子之一是QseBC系统。对DNA复制起始基因dna A表达测量结果得知,qse C与dna A之间存在密切调控关系,当qse C表达降低则增加dan A基因表达。对QseBC系统相关的TCS系统基因表达结果显示,Δqse C、Δqse B和Δqse BC中,TCS系统细胞膜蛋白Bas S和Pho Q的基因表达量下降;在Δqse BC中,其他非同源TCS系统胞内蛋白Kdp E的基因表达量增加约5.7倍。本研究通过对QseBC系统进行功能验证,将细菌运动结合TCS系统对消除BF形成进行针对性研究,为后续开发BF抑制剂或抗微生物感染提供有效作用靶点。