第一章超生理水平雌激素对多囊卵巢综合征患者及排卵正常患者体外受精-胚胎移植妊娠结局影响的临床研究背景:控制性促排卵是目前体外受精-胚胎移植技术不可或缺的组成部分,它通过注射外源性促性腺激素促进多个卵泡的同步发育,较既往的常规自然周期取卵,大大增加了每次取卵周期的获卵数及胚胎数,提高了体外受精技术的助孕成功率。但是控制性促排卵技术在增加发育卵泡数的同时,也使得卵泡分泌的雌二醇水平显著增加,促排卵周期体内雌二醇水平是自然周期雌二醇水平的数十倍。近年来的研究提示,超生理水平的雌二醇可能导致子宫内膜着床相关基因表达异常,内膜着床窗提前,卵巢高反应患者鲜胚移植周期的妊娠率低于卵巢反应正常或偏低患者。针对上述问题,近年来提出了“全胚冷冻”策略,将获得的胚胎全部冷冻保存,择期行冻胚移植,以期避免超生理水平雌激素对胚胎着床的影响。我们团队既往开展了两项大样本多中心随机对照临床试验,分别在1508例多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)患者及2157例排卵正常的患者中,比较了在卵裂球期阶段进行冻胚移植与鲜胚移植的妊娠结局,两项研究结果并不一致。在PCOS患者中,与鲜胚移植比较,冻胚移植可降低流产率、提高活产率,增加单胎新生儿的出生体重;但在排卵正常的患者,冻胚移植组与鲜胚移植组的妊娠率、流产率、活产率及出生体重均未见显著差异。目的:明确超生理水平雌激素对妊娠结局的影响在PCOS患者与排卵正常患者之间是否有人群差异;确定导致发生鲜胚移植周期妊娠率下降的雌激素阈值;评价雌激素水平超过阈值的卵巢高反应患者应用全胚冷冻-冻胚移植策略是否能有效改善妊娠结局。方法:我们对既往两项随机对照临床研究数据进行了进一步的分析,分别在多囊卵巢综合征患者与排卵正常的患者中,纳入年龄、体重指数(Body Mass Index,BMI)、不孕年限、既往妊娠史、HCG日雌二醇水平(作为连续变量纳入)或者获卵数(作为连续变量纳入)、干预措施分组(冻胚移植vs.鲜胚移植)、以及干预措施分组与HCG日雌二醇水平或获卵数的交互项,通过Logistic回归分析,判断卵巢反应性与干预措施分组之间是否存在交互作用。继而我们通过对不同雌激素水平、不同获卵数患者冻胚移植或鲜胚移植的妊娠结局作图,直观分析妊娠结局随上述两个指标的变化规律。最后,结合logistics回归分析的结果以及作图的结果,判断HCG日雌二醇水平及获卵数亚组的划分界值,并在不同的亚组中比较了全胚冷冻-冻胚移植与鲜胚移植后的妊娠结局(临床妊娠率、临床妊娠流产率、活产率)。结果:在PCOS患者中,对于临床妊娠流产率及活产率而言,HCG日雌二醇水平与干预措施分组之间存在交互作用,表明在PCOS患者中不同雌二醇水平对冻胚移植vs.鲜胚移植后妊娠结局之间差异的影响不同。当雌二醇>3000pg/ml,与鲜胚移植组比较,冻胚移植组的流产率显著降低(11.6%vs.26.3%,OR:0.37,95%CI:0.23-0.57),活产率显著增加(51.9%vs.40.7%,OR:1.57,95%CI:1.22-2.03);但雌二醇≤3000pg/ml时,冻胚移植与鲜胚移植后的流产率(21.5%vs.22.8%,OR:0.93,95%CI:0.53-1.62)及活产率(45.1%vs.44.4%,OR:1.03,95%CI:0.72-1.47)无显著差异。而在排卵正常的患者中,无论是临床妊娠率、临床妊娠流产率,或者活产率,HCG日雌二醇水平与干预措施分组之间均未发现交互作用,表明在排卵正常的患者中,不同雌二醇水平对冻胚移植vs.鲜胚移植后妊娠结局之间差异的影响并无不同。无论雌二醇≤3000pg/ml还是>3000pg/ml,冻胚移植与鲜胚移植的临床妊娠率、临床妊娠流产率、以及活产率之间均无明显差异。结论:超生理水平雌激素对妊娠结局的影响有人群差异,在PCOS患者中,过高水平的雌激素与鲜胚移植后流产率增加、活产率降低相关;而在排卵正常的患者中,雌激素水平高低与鲜胚移植后妊娠结局无明显相关。在PCOS患者中,就对鲜胚移植周期妊娠结局的影响而言,过高雌二醇水平的诊断界值为3000pg/ml;对于HCG日雌二醇>3000pg/ml患者,选择全胚冷冻策略,择期行冻胚移植,可获得更高的活产率。超生理水平雌激素对PCOS患者流产风险影响的机制仍不明确,将来仍需要更多的临床及基础研究证实我们的结果,并进一步解析其内在的分子机制。第二章高雌激素联合高雄激素或/和高胰岛素对绒毛外滋养细胞生物学行为的影响及机制研究背景:在第一章中,我们通过临床研究发现,在PCOS患者中控制性促排卵过程产生的过高水平的雌激素(>3000pg/ml)与鲜胚移植后临床妊娠流产率增加密切相关;而在排卵正常的患者中未观察到这种现象。这种在不同人群中差异性结果内在的机制尚不明确。临床观察性研究显示,具有高雄表现的PCOS亚型患者孕产期并发症的发生风险显著高于其他PCOS亚型;高雄亚型患者中胎盘肉眼异常与显微镜下异常以及绒毛炎的发生率较其他亚型明显增加;合并胰岛素抵抗的PCOS患者发生流产的风险高于胰岛素水平正常的PCOS患者。因此,我们推测,PCOS患者特征性的内分泌及代谢异常与过高水平的雌激素之间可能存在联合作用,共同介导了鲜胚移植后不良孕产结局的发生。既往的多数研究中,主要关注了超生理水平雌激素对子宫内膜容受性的影响,研究发现子宫内膜容受性异常可导致胚胎着床失败,通常表现为未妊娠或生化妊娠流产。然而,我们在临床研究中的结果显示,在PCOS患者中,雌激素水平>3000pg/ml时,鲜胚移植组的临床妊娠率与冻胚移植组无明显差异,但临床妊娠之后的流产率显著增加,提示鲜胚移植周期不良的母体内环境(高雄及胰岛素抵抗与过高的雌激素),可能对着床期的胚胎的发育也有不利的影响。在胚胎着床后,绒毛外滋养细胞(EVTs)将迁移至母体子宫内膜、诱导子宫螺旋小动脉重塑过程,这对正常胎盘的形成及妊娠的维持至关重要。EVTs的增殖、迁移与侵袭过程受到多种因素的调节;而目前关于过高水平雌激素对EVTs增殖、迁移与侵袭能力的影响,不同研究结果之间仍存在争议,而且高雌激素与高雄或/和高胰岛素协同作用对EVTs生物学行为影响的相关研究极少。目的:利用绒毛外滋养细胞HTR8/SVneo细胞系,观察不同浓度17β雌二醇及其联合不同浓度睾酮或/和胰岛素对细胞增殖及迁移能力的影响;并通过蛋白质组学等方法初步探索内在的作用机制。方法:通过携带荧光蛋白载体的慢病毒感染HTR-8/SVneo细胞,使细胞表达绿色荧光蛋白,采用可自动进行图像采集与分析的Celigo高通量筛选系统进行细胞增殖实验、细胞划痕迁移实验。在慢病毒感染后的HTR-8/SVneo细胞中,通过加入不同浓度、不同组合的17β雌二醇、睾酮、胰岛素单独或联合干预,于实施干预后1-5天每天进行细胞计数,并计算增殖倍数。利用专门的划痕仪在96孔细胞培养板上制好划痕,实施上述不同浓度、不同药物组合的干预措施,于0h及24h观察并记录细胞面积,计算细胞迁移率。继而,根据上述细胞增殖及迁移实验的结果,挑选出组间差异明显的干预组。在未经慢病毒感染的HTR-8/SVneo细胞中,分别实施挑选出的干预,通过串联质谱标签法(Tandem mass tag,TMT)进行蛋白质组学测定,以≥1.2或≤0.83为倍数阈值筛选差异表达的蛋白;并利用PRM(parallel reaction monitoring)靶向蛋白组学定量技术进行差异表达蛋白验证。结果:与空白对照组比较,单独加入雌二醇10nM或以上时,可使细胞平均增殖倍数降低(4.23 vs.4.80,P=0.022),并且有剂量-反应关系;单独加入雌二醇,无论何种浓度,对细胞迁移率无明显影响。与空白对照组比较,单独加入睾酮100nM时,细胞平均增殖倍数降低(4.31 vs.4.80,P=0.022),当加入低浓度睾酮时,细胞增殖倍数无明显变化;单独加入睾酮对细胞迁移率无显著影响。然而,与空白对照组比较,单独加入胰岛素对细胞平均增殖倍数无显著影响;而当胰岛素浓度5nM或以上时,可明显降低细胞迁移率(42.01%vs.56.72%,P=0.009),呈剂量-反应关系。与单独加入雌二醇10nM组比较,同时加入雌二醇10nM与睾酮100nM,细胞平均增殖倍数无明显差异(4.00 vs.4.23,P=0.079),而细胞迁移率显著下降(41.11%vs.57.16%,P=0.003)。同时加入雌二醇10nM与胰岛素5nM组,与单独加入雌二醇10nM组比较,细胞平均增殖倍数无明显差异(4.03 vs.4.23,P=0.132),而细胞迁移率显著下降(36.85%vs.57.16%,P=0.002);而当与单独加入胰岛素5nM 比较时,细胞迁移率无明显差异(36.85%vs.42.01%,P=0.170)。蛋白质组学的结果显示,与单独加入雌二醇10nM 比较,同时加入雌二醇10nM与睾酮100nM可使得TPM1、CALD1等与迁移功能密切相关的细胞骨架蛋白的表达水平显著升高。结论:高雌激素与高雄激素之间可能存在联合作用,二者共同可导致绒毛外滋养细胞的迁移功能下降;该作用可能是通过影响细胞骨架蛋白的表达水平而介导的,而确切的作用机制仍有待于进一步研究。