新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒强毒株引起的一种高度接触性禽类烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，在我国将其列为一类动物疫病。近年来，随着我国防控工作力度的加大，疫情发生几率明显下降，感染率总体维持到较低水平。但是局部地区仍然污染严重，呈现持续性地方流行。当前我国流行的毒株为基因Ⅶ型，而当前最广泛的疫苗株多为基因Ⅱ型，疫苗组与流行株基因型的不匹配，是导致非典型新城疫多发的可能原因之一。虽然市场上有针对基因Ⅶ型ND灭活苗，但是由于灭活疫苗免疫方式导致雏鸡缺乏粘膜免疫无法在消化道与呼吸道形成有效屏障抵抗NDV侵入。因此，研发一种安全、高效、能够刺激机体产生粘膜反应的亚单位疫苗具有重要意义。
　　细菌样颗粒(Bacterium-like particles，BLPs)是一种新型非遗传修饰型乳酸菌表面展示技术，外源蛋白可通过乳酸乳球菌肽聚糖锚钩蛋白(Protein anchor，PA)锚定于经热酸处理而得的乳酸乳球菌肽聚糖骨架表面，形成空心抗原展示颗粒。BLPs表面展示系统有着高度的安全性、抗原展示密度大、具有自体佐剂效应等优点，在粘膜疫苗研制上有着巨大的发展潜力。
　　本实验立足于BLPs技术平台，以与当前流行毒株基因型一致同为基因Ⅶ型NA-1株为研究对象，利用原核表达系统，构建表面展示新城疫病毒保护性抗原(F蛋白)细菌样颗粒，并从免疫抗体水平、攻毒保护、体内肺部病毒载量和排毒反应四个方面对其免疫效果进行评价，本研究内容及结果如下。
　　1.表面展示新城疫病毒F蛋白细菌样颗粒的构建
　　本研究利用融合技术，将新城疫F蛋白胞外区编码基因与锚钩蛋白PA基因融合；利用大肠杆菌原核表达系统获得与锚钩蛋白(PA)融合的F蛋白即F-PA蛋白。通过Western-blot鉴定F-PA蛋白正确表达。用热酸处理乳酸乳球菌从而获得裸露的BLPs颗粒，通过透射电镜观察到其胞质内大量蛋白和核酸已去除，表明裸露的BLPs颗粒制备成功。将复性后的F-PA蛋白与裸露的BLPs颗粒在室温下孵育结合，通过透射电镜、SDS-PAGE、Western-blot、细菌免疫荧光检测到F-PA蛋白成功锚定在裸露的BLPs颗粒，即形成了表面展示新城疫病毒F蛋白细菌样颗粒(BLPs+F),其最大结合效率为130μg/1U(2.5×109BLPs颗粒)。
　　2.BLPs+F免疫效果评价
　　选取蛋鸡作为实验动物，第14、28、42天对雏鸡进行免疫，分别进行滴鼻免疫(IN)和肌肉注射免疫(IM)来探究不同的免疫策略下的免疫原性和攻毒保护力的差异。免疫分组为130μg的NDVF蛋白分别通过滴鼻免疫(IN)和肌肉注射免疫(IM)；130μgNDVF蛋白锚定在1U的BLPs颗粒后分别通过滴鼻免疫(IN)和肌肉注射免疫(IM)；NDV商品化疫苗组按照商品说明书进行免疫。在三免后一周采取雏鸡外周血、收集气管灌洗液，通过流式细胞术，检测各组雏鸡外周血中CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞和B细胞含量，并利用间接ELISA方法对气管灌洗液中sIgA抗体含量和血清中特异性抗体NDV-Ab及IL-4、IFN-γ细胞因子等水平进行检测。在三免后第二周，使用NDVNA-1株对各组雏鸡通过滴鼻方式攻毒，观察攻毒后的雏鸡状态、统计雏鸡死亡率。在攻毒后3、5、7d收集口咽和泄殖腔棉拭子用于排毒检测，攻毒后第5d收集肺部组织做肺部病毒含量检测和肺部病理切片。
　　结果显示，在滴鼻免疫和肌肉注射下的BLPs+F都可以增加雏鸡外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞和B细胞含量，增加血清中特异性抗体NDV-Ab、和细胞因子IFN-γ含量。攻毒保护实验中，实验组BLPs+F(IN)和BLPs+F(IM)都可以对雏鸡提供一定的保护率，BLPs+F(IN)保护率可达78％，肺部病理变化和病毒含量明显降低。滴鼻免疫能诱导粘膜免疫产生，在口咽排毒量检测、肺部病毒含量和肺部病理变化上要优于肌肉注射。
　　综合以上结果说明，表面展示新城疫病毒F蛋白细菌样颗粒(BLPs+F)免疫雏鸡后能够诱导较高水平的体液免疫和细胞免疫应答，对受基因Ⅶ型新城疫病毒攻击后可以相对提高雏鸡存活率、具有保护作用，同时降低雏鸡排毒反应，有效的阻止病毒向外界扩散，在防控基因Ⅶ型新城疫病毒上有很大的优势。