肿瘤细胞快速增殖和分化会消耗大量氧气而导致肿瘤内缺氧的现象是肿瘤的特征之一。临床数以千计的不同研究表明瘤内缺氧所引起的缺氧诱导因子HIF-1α的活化与肿瘤病人发生转移、肿瘤复发以及病人死亡率有明显的关系。HIF-1是低氧调控的关键核转录因子,由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成,可调控下游大约1000多个靶基因的表达。这些HIF-1介导的基因与肿瘤发生发展过程中的很多重要方面都有密切的关系,例如代谢重组,肿瘤血管生成,侵袭转移,上皮-间质转化,干细胞维持以及放化疗耐受。原发肿瘤中有极小一群肿瘤细胞具有自我更新能力,肿瘤形成能力以及多向分化潜能,在促使肿瘤形成和维持其增殖,以及导致肿瘤转移复发中起必不可少的作用,这部分细胞被称为肿瘤肝细胞(CSCs)。现在已有大量文献报道在很多不同类型的肿瘤中都发现肿瘤干细胞的存在,而缺氧环境下HIF1的活化则可上调肿瘤干细胞的数量以及维持其表型,然而,其中的调控机制却仍不清楚。最近有文献报道,Hippo信号通路的效应因子名为具有PDZ结合模序的转录共激活因子(TAZ)对乳腺癌干细胞的自我更新以及肿瘤形成发挥关键作用。TAZ在大于80%的晚期乳腺癌病人中高表达,但研究表明TAZ编码基因WWTR1在乳腺癌中的扩增不到10%,提示可能有其他调控机制参与其中。与此同时,我们发现HIF的靶基因与TAZ下游调控基因有非常高的重合率,这提示我们HIF与TAZ之间可能存在密切的相互调控关系。代谢方式的适应性改变是肿瘤在发生发展过程中的显著特征之一。许多参与调节细胞代谢的癌基因在这一过程中活化,导致肿瘤细胞发生代谢方式的改变,以帮助它们适应外界恶劣的环境(如放射线和化学药物治疗),然而除代谢调控基因以外,放化疗也可活化HIF-1的表达。HIF-1的表达激活下游基因葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)转录,促进细胞代谢方式从有氧氧化向糖酵解转变,同时限制代谢产物乙酰辅酶A(acetyl-CoA)的转化生成。乙酰辅酶A的降低使其作为底物参与三羧酸循环的过程也被抑制,导致肿瘤用于脂肪酸合成的主要底物从葡萄糖转变为谷氨酰胺。基因芯片分析结果显示在放疗耐受的宫颈癌细胞中谷氨酰胺酶2(gls2)显著高表达,提示我们对放射线治疗产生耐受的肿瘤细胞可能存在适应性的谷氨酰胺代谢活化,然而其潜在调控机制尚不清楚。【研究目的】1.研究hif-1α对乳腺癌干细胞表型的影响作用,进一步探讨hif-1与taz之间的相互调控机制以及hif-1通过作用hippo信号通路对taz核转位的影响作用;2.研究hif-1α对调控宫颈癌细胞谷氨酰胺代谢重编程诱导放疗耐受的作用机制。【研究方法】1.利用肿瘤基因tcga数据库分析wwtr1基因与hif靶基因之间的表达相关性。对于细胞缺氧处理,采用缺氧小室培养细胞,室内灌入1%氧气、5%氮气和94%二氧化碳。采用免疫组化染色、实时定量pcr和westernblot检测乳腺癌组织及细胞中taz的表达情况。利用荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀技术检测hif-1对taz以及siah1基因启动子活性的转录调控作用。利用免疫共沉淀技术检测lats2和siah1之间的蛋白结合作用。免疫荧光染色用于检测taz的核定位。采用aldefluor干细胞检测试剂盒、流式细胞仪和乳腺干细胞成球实验检测hif-1和taz对乳腺癌干细胞表型维持的调控作用。为高效敲低taz,siah1和lats2的蛋白表达水平,采用慢病毒plko.1嘌呤霉素质粒编码的rna干扰载体,分别与pcmv-dr8.91同时转染293t细胞,收集得到的慢病毒上清液再转染乳腺癌细胞,并采用嘌呤霉素筛选得到有效的干扰细胞系。运用kaplan–meier生存曲线及wilcoxon秩和检验分析乳腺癌病人双阳性hif-taz靶基因对比双阴性或单阳性hif-taz靶基因的存活率差异。2.研究hif-1调控宫颈癌细胞谷氨酰胺代谢重编程以及其放疗耐受产生的机制,首先采用2gy的放射线连续亚致死剂量照射宫颈癌hela细胞株,重复照射25次,总剂量达50gy,总时长为6个月左右。利用免疫组化染色和westernblot实验检测gls2的蛋白表达水平。建立gls2慢病毒干扰载体,首先设计gls2-shrna干扰序列并插入慢病毒pgcl-gfp绿色荧光蛋白质粒载体,并且做后续的细胞转染和筛选。克隆形成实验和流式细胞计数分别用于检测各处理组的放疗敏感性变化以及细胞凋亡和细胞周期改变。免疫荧光染色二氢乙锭用于检测细胞内活性氧水平变化。比色酶标检测试剂盒用于检测样本中还原型和氧化性谷胱甘肽的比率差异。nad+/nadh比率检测试剂盒和nadp+/nadph定量比色分析试剂盒分别用于检测nadh和nadph的水平变化情况。建立小鼠移植瘤模型,对比不同处理组细胞的增殖能力。最后,采用免疫组化染色及进行gls2与宫颈癌病人临床病理学特征的相关性分析。【研究结果】1.hif-1和taz之间的多重调控机制以及其对乳腺癌干细胞表型的调控作用1.1通过分析肿瘤病人基因数据库得出基因表达热图显示tazmrna表达水平与随机输入的10个hif靶基因呈显著正相关。实时定量pcr和westernblot结果提示taz的mrna及蛋白表达水平在5种不同的乳腺癌细胞株经过缺氧处理后呈显著高表达,然而在hif-1α敲低细胞株中,taz的高表达受到明显抑制。利用ucsc基因数据库分析taz编码基因wwtr1基因序列中的潜在hif结合位点最终得到在此基因反义链的第二个内含子内的一段序列5’-gcgtggcacaca-3’,并且chip实验证明这段序列为hif-1α和hif-1β的结合位点。最后,利用荧光素酶报告基因检测这一结合位点是否具有功能性,结果显示,野生序列载体荧光素酶活性在缺氧条件下显著升高,而突变序列载体则转录收到抑制。1.2敲低taz未影响hif-1α或者hif-2α的蛋白表达。通过chip实验证明,敲低hif-1α或者hif-1β可影响taz与其下游靶基因ctgf的结合水平。taz靶基因ctgf、pai-1和survivin的mrna和蛋白水平在乳腺癌细胞株缺氧条件下也受hif-1α的调控。次外,免疫荧光染色和westernblot结果显示taz在常氧条件下主要表达在细胞质中;而缺氧条件下taz大量定位在细胞核中表达,胞质中其分布则相应有所下降。1.3为进一步探讨缺氧对于hippo信号通路的影响,采用westernblot检测其通路级联反应中lats家族的表达变化,发现只有lats2的蛋白水平受到抑制,并且这一过程为hif依赖的调控方式。分析与缺氧相关的e3泛素蛋白连接酶发现其中siah1受hif-1调控,且lats2在缺氧环境下的降解是通过泛素蛋白酶体降解途径。进一步采用chip实验检测出hif-1与siah1的hre结合位点。1.4采用aldefluor干细胞检测试剂盒、流式细胞仪和乳腺干细胞成球实验检测缺氧对乳腺癌干细胞干性维持的调控作用,结果提示aldh阳性的干细胞百分比在缺氧条件下显著升高,干扰hif-1α或taz降低乳腺癌干细胞数量及成球能力。另外,敲低siah1或lats2也能影响乳腺癌干细胞表型及taz细胞核转位。进一步在动物试验中验证这一结果显示hif-1α敲低细胞的成瘤能力显著受到抑制。最后,kaplan–meier生存分析表明双阳性表达hif和taz靶基因特征的乳腺癌病人的生存率显著降低。2.hif-1对宫颈癌谷氨酰胺代谢重编程及其所致的肿瘤放疗耐受的调控作用2.1建立宫颈癌helar放疗耐受细胞株,其次采用克隆形成实验及流式细胞仪测细胞凋亡和细胞周期实验来验证此细胞株放疗耐受特性的确立。进一步通过基因芯片分析放疗耐受细胞株与敏感细胞株的基因表达谱差异,发现谷氨酰胺代谢通路及其关键酶GLS2的活化在宫颈癌放疗耐受细胞株中明显上调。紧接着干扰GLS2发现,放疗耐受组细胞的克隆形成能力显著降低,放疗敏感性增加。此外,对比放疗耐受组细胞与对照组细胞在接受6 Gy剂量放射线照射后48小时的细胞凋亡数量发现,GLS2干扰组检测到更多的细胞凋亡量。2.2流式细胞仪检测发现敲低GLS2显著增加放射线照射后细胞内ROS的生成。进一步检测还原型和氧化型谷胱甘肽的比率发现,GSH/GSSG比率在放疗耐受HelaR细胞株中显著呈高比率状态,而GLS2敲低细胞中此比率明显下降。与GSH相似,检测抗氧化剂NADH以及NADPH在不同细胞组中的水平变化,发现还原型NADH和NADPH也在放疗耐受细胞株中呈较高水平状态,而在GLS2敲低细胞中其生成明显下降。2.3建立小鼠移植瘤模型用体内实验进一步验证GLS2对宫颈癌放疗耐受的调控作用。结果证明放疗耐受的宫颈癌细胞移植瘤组小鼠肿瘤增殖明显高于野生宫颈癌细胞移植瘤组,然而GLS2敲低后,小鼠移植瘤增殖得到抑制。另外,免疫组化染色临床宫颈癌病人标本显示GLS2在对放射线治疗耐受的病人标本中表达明显高于放疗敏感的病人肿瘤组织。统计学分析进一步提示GLS2的表达与宫颈癌放疗敏感性高度相关。最后,基因表达相关性分析表明GLS2 mRNA与HIF靶基因表达呈显著正相关性。实时定量PCR和Western blot实验结果证明HIF-1α干扰细胞中GLS2表达明显下调。【主要结论】1.TAZ是HIF-1的靶基因;HIF-1可影响和调控TAZ的转录活性;HIF-1α调控SIAH1依赖的LATS2泛素化降解,以及TAZ核转位;HIF-1-TAZ调控轴在对乳腺癌干细胞表型的影响中起到重要的作用。2.放射线介导的HIF-1α调控宫颈癌谷氨酰胺代谢关键酶GLS2高表达,诱导其肿瘤细胞谷氨酰胺代谢过度活化,导致胞内谷胱甘肽生成增加而活性氧水平下降从而增加宫颈癌细胞对放射线的耐受性;阻断GLS2则增加宫颈癌细胞对放疗的敏感性。