牛骨约占牛重量的20%,是肉牛产业中的主要副产物之一。牛骨中蛋白含量为20%左右,主要为Ⅰ型胶原蛋白,是制备胶原蛋白肽的优质原料。本文以牛骨为原料,优化提取牛骨胶原蛋白（Bovine bone collagen,BBC）的预处理方式,利用酶解技术制备牛骨胶原蛋白酶解物（Bovine bone collagen hydrolysates,BBCH）;通过阳离子交换色谱、反相液相高效色谱对其进行分离纯化后,利用质谱技术鉴定酶解物中多肽的氨基酸序列;以大鼠L6细胞为体外模型评价BBCH的生理活性,并利用在线软件对鉴定肽段的其它功能进行预测。本研究为开发具有生理活性潜力的BBCH做了尝试,为拓宽肉牛畜禽副产物的应用提供了一定的科学依据。本论文主要研究内容和结果如下:1、牛骨预处理过程对BBC理化性质的影响。本论文测定了牛骨组分成分,研究了高温高压预处理（121℃,0.1 MPa）、高温预处理（100℃）和酸碱粗提法（10%醋酸溶液,0.08 mo L/L氢氧化钠溶液）三种方法对胶原蛋白提取及其理化性质影响。结果表明,牛骨中总蛋白含量为22.50±2.6 g/100g,其中胶原蛋白含量为20.50±2.9 g/100g,脂肪含量为20.89±2.8 g/100g,灰分含量为36.01±3.1 g/100g。三种预处理方法中高温高压法最优,BBC得率为63.67±1.9%,粒径为404.3±6.1nm,热变性温度为85℃,羟脯氨酸含量为4.95±0.8 g/100g、总氨基酸含量为41.43±1.8 g/100g。通过SDS-PAGE分析可以观察到两条清晰的α链,二级结构检测表明胶原蛋白三条链间部分氢键被打开,各链完整性依然较好。2、不同预处理过程对BBCH得率和特性的影响。将高温高压预处理、高温预处理后的BBC利用胰蛋白酶酶解,比较酶解物多肽特性。结果表明,高温高压法预处理后BBCH总蛋白含量为81.62±3.1 g/100g,总蛋白回收率高达73.60±1.3%,胶原蛋白回收率高达76.71±6.3%,BBCH胶原蛋白含量、得率、回收率均远高于仅高温预处理后酶解的样品。经高温高压预处理后酶解得到的BBCH粒径为237.40±5.3 nm,分子量小于1500 Da的部分占68.76%,总氨基酸的含量达58.26±1.5 g/100g。通过质谱鉴定发现BBCH中的大部分肽段来自牛源Ⅰ型胶原蛋白的α1和α2链,具有胶原蛋白特有的特征多肽重复序列。3、BBCH制备工艺的建立和功能活性的研究。本研究选取了4种商品蛋白酶（碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和动物蛋白水解酶）,采用单酶和双酶复配的方式对BBC进行酶解,综合酶解物蛋白和胶原蛋白的得率、回收率、分子量,对L6细胞增殖作用和葡萄糖吸收作用等指标评价酶解效果。结果表明,单酶酶解后产品仅得率和水解度略低于复配酶。在L6细胞模型中1 mg/m L浓下,单酶BBCH的细胞增殖效果比复配酶组好,其中胰蛋白酶酶解得到的BBCH组增殖效果最好;同时发现单酶BBCH促进L6细胞的葡萄糖吸收的效果均显著,也是胰蛋白酶酶解物效果最好。4、BBCH的分离纯化及类胰岛素活性探究。利用阳离子交换色谱、C18反相高效液相色谱对胰蛋白酶酶解得到的BBCH进行连续分离纯化,通过L6细胞葡萄糖吸收实验,比较各组分生理活性,筛选出活性最强组分,再利用反向液相色谱-串联质谱（RPLC-MS/MS）鉴定和表征其多肽序列,结果表明组分中多肽主要来自牛源Ⅰ型胶原蛋白的α1（P02453）和α2（P02465）链的肽段。通过在线软件技术预测质谱鉴定到的多肽的功能,发现它们可能具有血管紧张素转换酶（ACE）和二肽基肽酶IV（DPP IV）的抑制活性。以上研究结果表明,牛骨经过提取、酶解、分离纯化后能够得到有促L6细胞葡萄糖吸收活性的BBCH,具有潜在的降血糖作用,其生理活性及作用机理值得进一步深入挖掘。本研究为牛骨的高值化利用提供了思路。