蝙蝠粪便中细菌新种的发现和基因组分析

来源 :广西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qq462283910
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目的:蝙蝠是多种病原体的自然宿主,能够引起多种人类新发传染病。近年来因可携带多种高致病性病毒而引起高度关注,但对于蝙蝠粪便(肠道)的菌群结构以及是否携带致病菌的研究十分有限。本研究采用16S r DNA扩增子测序技术,结合传统分离培养方式对源自我国5个地理位置且种类不同的蝙蝠粪便样本的细菌菌群进行了分析和培养研究,丰富微生物目录,同时评估新发现细菌的潜在致病性或者公共卫生意义,以期预防和减少各类传染病的发生,为我国制定有效防控新发突发传染病的公共卫生策略提供科学依据。方法:(1)利用16S r DNA扩增子测序技术针对16S r DNA高变区域(V3-V4)进行测序,将测序结果与Silva数据库进行序列比对,相似性大于97%的序列被列为一个物种操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTU),在每一个OTU中,出现频数最高的序列被选为这个OTU的代表性序列,并用KRONA软件对分类结果进行统计。(2)根据培养组学的思路设计多种培养方案,采用传统分离培养方式对粪便样本进行细菌分离培养,挑取菌落颜色、直径大小、边缘状况和表面光滑程度等形态各异的单菌落进行传代纯化和菌株保存。提取相应纯培养菌株的核酸进行16S r RNA基因扩增后测序,将获得序列在Gene Bank和Ez Taxon数据库中比对,根据比对结果,按照菌株多样性原则将不同种类的菌株传代培养后刮取适量菌体装入甘油管中并放置在-40℃以下温度保存。(3)根据初步鉴定结果,若为已知种,则对菌株进行多样性分析;若为疑似新种,则完成表型、生理生化和遗传特征分析来明确其分类学位置,包括细菌形态特征、最适生长条件、生化反应、菌体成分鉴定、系统进化关系分析、毒力基因等基因组分析以及生物学意义的挖掘。并为其命名和寄送模式菌株至中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)和日本微生物保藏中心(JCM)保藏,获得相应的菌种保藏证明。结果:(1)16S r DNA扩增子测序技术分析结果表明,蝙蝠粪便样本中细菌具有多样性,聚类总计产生752个OTUs,隶属于19个门、34个纲、68个目、116个科和241个属。5份粪便样本中的细菌主要分布在变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),为优势菌门。变形菌门在墓蝠(Taphozous spp.)、菊头蝠(Rhinolophus spp.)和鼠耳蝠(Myotis spp.)粪便样本中的丰度最高,分别占其84.63%、61.70%和51.97%;果蝠(Rousettus spp.)粪便样本中分布最广的是拟杆菌门(Bacteroidetes),占比52.97%,其次是变形菌门(Proteobacteria,30.55%)和放线菌门(Actinobacteria,7.33%);蹄蝠(Hipposideros spp.)样本中分布前三的门类分别是拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门,分别占45.42%、29.70%和22.39%。(2)利用传统分离培养方式从蝙蝠粪便样本中成功分离鉴定195株菌,集中分布于4个门(放线菌门、厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门),6个纲(放线菌纲、芽孢杆菌纲、黄杆菌纲、α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲),10个目,30个科,50个属和110个种。优势菌属包括微杆菌属(Microbacterium)、肠球菌属(Enterococcus)和红球菌属(Rhodococcus)。初步鉴定为疑似细菌新种有93株,占细菌总数的47.69%,包含26个种,隶属于17个属,微杆菌属为优势菌属,占疑似细菌新种数的19.4%。有19株细菌初步鉴定为潜在病原菌,占细菌总数的9.74%,可鉴定为15个种,隶属于8个属,其中肠球菌属和葡萄球菌属(Staphylococcus)分别占潜在病原菌数的26.32%和21.05%。(3)综合细菌表型、菌体成分、生理生化特征、系统进化关系和基因组分析结果,支持将菌株HY041T和HY039划分为蜂杆菌属的一个新种,命名为饶子和蜂杆菌(Apibacter raozihei sp.nov.),模式菌株为HY041T(=CGMCC 1.16567T=JCM 33423T)。菌株HY041T和HY039是兼性厌氧菌,杆状,无鞭毛和芽孢,革兰氏染色和动力实验阴性。菌株在BHI-5%脱纤维羊血培养基上生长最好,菌落呈黄色、圆形凸起,表面光滑湿润,直径大小约2.0 mm。菌株HY041T,HY039与Apibacter adventoris wk B301T和Apibacter mensalis R-53146T的16Sr RNA基因序列相似性最为接近,分别为95.2%和94.0%,与它们基因组在线两两杂交的ANI值(73.8-74.8%)和DDH值(22.6-26.2%)均低于原核生物物种界限划分的阈值(ANI,95-96%;DDH,70%)。菌株HY041T和HY039染色体的DNA G+C含量分别为32.2mol%和32.0mol%。MK-6是菌株唯一的呼吸醌;极性脂质含有糖脂,磷脂酰乙醇胺,2个未识别的氨基脂质和4个未识别的脂质;主要脂肪酸(含量>10%)是C16:0,iso-C15:0和iso-C17:03OH。菌株HY041T基因组全长为3,293,048 bp,共有2912个基因,其中编码基因有2841个,含有9个r RNA和43个t RNA。通过与致病菌毒力因子数据库比对发现菌株基因组中存在编码溶血素(Acp C,cyl G和hyl A)和尿素酶(ure A,ure B,ure F和ure G)等具有一定损伤或杀死细胞作用的致病基因。结论:蝙蝠粪便中的细菌种类丰富,含有数百种细菌,包括多种潜在病原菌和未知细菌。发现和命名了饶子和蜂杆菌(Apibacter raozihei),并初步分析了细菌基因组,发现有多种毒力基因,可能存在致病性,其医学意义有待进一步研究。
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