Neddylation修饰是体内一种广泛的翻译后修饰作用，通过 NEDD8类泛素蛋白小分子与底物蛋白的结合而实现这种修饰作用。该修饰作用广泛地参与细胞内的多种调控，如信号转导、DNA损伤、细胞增殖与分化、细胞周期、细胞凋亡、蛋白质转运等过程。最近研究发现，流感病毒蛋白PB2能被Neddylation修饰而导致PB2蛋白的稳定性降低，从而抑制了流感病毒的复制。可见在流感病毒感染过程中，体内的 Neddylation 修饰起到了一种抗病毒作用。本研究通过构建Neddylation通路关键酶——NEDD8活化酶（E1）的Knock down（KD）细胞系，并用流感病毒（PR8）感染，以探究流感病毒在KD细胞系中的增殖情况，为更好地阐述流感病毒与Neddylation通路之间的关系提供了依据。同时我们也制备了类泛素小分子蛋白NEDD8的单克隆抗体，这为今后更深入地研究内源性Neddylation修饰作用打下了良好的基础，为更好的阐述在病毒感染中Neddylation的免疫调控作用提供了实用的生物工具。本论文的主要研究结果如下：　　1．流感病毒在Knock down（KD）细胞系中的增殖效率升高　　将含有NAE1、UBA3靶序列的shRNA质粒以及Δ8.9、VSVG辅助质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装。将包装出来的慢病毒感染A549细胞，感染24h或48h后在培养基中加入嘌呤霉素，筛选出已被慢病毒感染的细胞，经扩大培养获得相应的KD细胞系，分别命名为NAE1-KD、UBA3-KD。用流感病毒（PR8，1MOI）感染获得的KD细胞系以及对应的对照组细胞系，感作2h后，弃上清并用无菌PBS洗去未结合的流感病毒，加入新鲜的培养基。在不同的时间点（6h、12h、24h、30h）收取细胞及细胞上清，每个时间点两个重复。通过Western blot、TCID50检测和实时荧光定量PCR检测发现，在KD细胞系中各个时间点，无论是病毒蛋白（NP、NS1）的表达水平，还是病毒蛋白的mRNA转录水平，或者是成熟病毒粒子滴度（TCID50）都较对照组细胞有明显上升，而且在 NAE1-KD细胞系中，这种上升趋势更加明显。因此，细胞中 E1的表达水平降低之后，能够促进流感病毒的复制。　　2．类泛素小分子蛋白NEDD8单克隆抗体的制备　　利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）从 A549 细胞中扩增出类泛素化蛋白编码的NEDD8基因，将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，测序验证后转化入BL21(DE3)进行异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，表达获得NEDD8蛋白，经纯化后，免疫接种6周龄BALB/c小鼠。细胞融合后，用酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹（WB）方法筛选单克隆抗体细胞株。结果成功制备获得3株单克隆抗体，分别命名为：4B7、1G11、1G3。免疫特异性鉴定结果表明：3株单克隆抗体都有良好的WB及ELISA效价。其中所得到的 1G11 株单抗适用于免疫共沉淀试验，可以特异性检测 NEDD8 修饰的Cullin-1底物。通过分段表达，鉴定单抗针对的抗原表位可能在 29RVEE32氨基酸区域，与泛素化蛋白（Ub）无交叉反应。本研究制备的特异性单抗为进一步鉴定NEDDylation修饰底物提供了良好的抗体工具。　　综上所述，本研究初步揭示了NEDDylation修饰过程中的活化酶NAE对流感病毒增值的抑制作用，且成功制备了类泛素化蛋白NEDD8的单克隆抗体，为深入研究流感病毒分子致病的免疫调控机制奠定了良好的基础。