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研究背景与目的肝癌是当前严重影响人类健康的恶性肿瘤之一,在全球范围内,肝癌的发病率居恶性肿瘤发病率的第五位,而其中约一半患者来自于中国,已成为我国人民生命健康的一大杀手。在临床诊疗中,由于肝癌早期诊断标志物不理想等原因,导致患者在发现肝癌时往往已经处于疾病晚期,严重影响了后续治疗效果。最新研究初步证实高尔基体膜蛋白Ⅱ(Golph2)具有肝癌早期标志物的特征,有望成为取代AFP的新一代肝癌标志物。本课题组前期已制备了抗Golph2多克隆抗体,经证实多克隆抗体能够特异性识别肝癌患者血清Golph2蛋白,本课题在此基础上制备抗Golph2单克隆抗体并建立一种能够快速有效检测血清中Golph2含量的方法——双抗体夹心ELISA法,为临床上提供早期诊断肝癌的方法奠定基础。研究方法构建Golph2原核表达体系并用IPTG诱导表达,利用His标签纯化试剂盒纯化可溶性的融合蛋白TRX-Golph2,并用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备抗Golph2的单克隆抗体并采用腹腔注射法大量制备抗Golph2单克隆抗体腹水,用Western blot、免疫细胞化学和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析单克隆抗体的特异性和相对亲和力。Sepharcryl S-300HR柱层析纯化单克隆抗体并用改良的过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶(HRP),通过棋盘滴定法优化建立双抗体夹心ELISA,并应用该方法检测肝癌患者血清中Golph2的含量。结果1.将pET21a(+)-TRX-Golph2融合基因转入RosettaTM菌株进行诱导表达。通过改变诱导温度、IPTG浓度、诱导时间最终发现在30℃、IPTG浓度为1.0mM,诱导10h时融合蛋白表达量达到最大值,Western blot证实为目的蛋白。最佳表达条件下诱导并裂解细菌,经SDS-PAGE确定为可溶性表达,可溶性融合蛋白约占总融合蛋白表达量的1/3。2.利用融合蛋白His标签与Ni+亲和的原理,经亲和层析成功纯化了可溶性的融合蛋白。3.按照常规步骤免疫BALB/c小鼠,经细胞融合制备杂交瘤细胞,克隆化后获得5株杂交瘤细胞系,经抗体亚型试剂盒鉴定为4株IgM,1株IgGl。腹腔注射法制备腹水,经间接ELISA测定效价均在1：10000以上,Western blot和免疫细胞化学验证具有较好的特异性。4.Sepharcryl S-300HR柱层析成功纯化了单克隆抗体,并用改良过碘酸钠氧化法成功标记HRP,直接ELISA测定HRP标记的单克隆抗体工作浓度为1：500。利用棋盘滴定法优化了建立的双抗体夹心ELISA体系,其中,血清稀释度为1：2,HRP标记单克隆抗体最佳工作浓度为1：500。5.用已建立的双抗体夹心ELISA法测定肝细胞癌患者和健康对照组血清Golph2含量,结果显示,血清中Golph2含量在肝细胞癌患者血清中明显升高,结果具有统计学意义(p<0.05)。结论1.成功诱导表达了TRX-Golph2融合蛋白,并在Native状态下成功纯化了融合蛋白。2.成功建立了5株杂交瘤细胞系,分别命名为5B7A5,5C6D5,7F5F3,8A7B4,8C9E8。经鉴定,其单克隆抗体均具有很高的效价及特异性。3.纯化并获得了较高纯度的单克隆抗体,成功用HRP标记一株单克隆抗体,其工作浓度为1：500。4.以棋盘滴定法成功优化建立了双抗体夹心ELISA检测体系,此体系可以用于血清中Golph2含量测定。5.经初步证实肝细胞癌患者血清Golph2含量明显高于对照组。