致病菌中抗生素耐药性的惊人增加对开发有效的治疗药物提出了严峻的挑战。抗微生物多肽引起了人们的广泛关注,是一种解决细菌耐药问题的潜在方案。来自不同生物体的大量宿主防御肽具有广谱抗菌、作用迅速和靶点耐药率低等优点,为开发新的抗感染药物开辟了新的途径。大约4.3亿年前,蝎子作为一种非常复杂的动物出现并进化。为了成功地生存,蝎子在长期的进化过程中产生了种类繁多的毒液多肽。作为一种蛛形纲动物,蝎子主要依靠先天免疫系统来对抗感染性微生物。许多抗微生物多肽已经作为蝎子先天免疫系统的一个重要组成部分从毒液中被鉴定出来。它们通常通过破坏细胞膜的完整性来迅速杀死细菌等微生物,其中一些还可以干扰细胞内部生理过程,比如影响细胞壁的生物合成途径,抑制蛋白质合成或与核酸相互作用。东亚钳蝎是一味重要的中药原料,通常被用来治疗一些神经系统、感染系统等相关疾病,在我国已经有千年的药用史。蝎毒液来源多肽具有潜在的医学前景和作为候选抗菌药物来源的潜力。本研究对东亚钳蝎毒液来源的四种抗菌多肽进行了系统的鉴定,并从彼得异蝎中筛选出新的抗菌多肽,揭示了它们的作用机制。首先,本研究在基因组水平、转录水平和蛋白质水平上系统地鉴定了东亚钳蝎毒液来源的四种抗菌多肽Bm Kb1、Bm Kn2、Marcin-18和Bm Kbpp。基于本课题组前期解析的东亚钳蝎基因组和转录组数据,通过PCR技术扩增到了Bm Kb1、Bm Kn2和Marcin-18的基因片段,只扩增出了Bm Kbpp基因的两个片段,没有获得Bm Kbpp的全长基因序列。这四个基因具有相同的基因组织结构,由两个外显子和一个具有GT-AG剪接位点的内含子组成。内含子A+T含量丰富,位于编码信号肽N端部分的DNA区域。通过实时定量PCR检测这四种抗菌多肽在东亚钳蝎毒腺中的RNA表达水平,发现Bm Kb1和Bm Kbpp的转录水平明显高于Bm Kn2和Marcin-18。通过构建细菌感染的全蝎模型,利用实时定量PCR检测细菌感染后这四种抗菌多肽在东亚钳蝎毒腺中的m RNA表达量,发现Bm Kb1和Bm Kn2在细菌感染后其m RNA表达量明显增加,而Marcin-18只在金黄色葡萄球菌感染后m RNA表达量明显增加,说明Bm Kb1、Bm Kn2和Marcin-18为诱导型转录表达。无论细菌感染与否,Bm Kbpp的m RNA表达量并无明显差异,说明Bm Kbpp为组成型转录表达。通过克隆这四个基因的启动子序列并对其进行分析后发现,与其他三个基因的启动子相比,Bm Kbpp的启动子缺乏某些典型的免疫应答元件,特别是NF-κB。采用RP-HPLC与2-DE蛋白质分离技术和MALDI-TOF MS与LC/ESI-Q-TOF MS质谱技术对东亚钳蝎的毒液进行了蛋白质组学分析,成功地证明了这四种抗菌多肽的确存在于东亚钳蝎的天然毒液。接着,本研究阐明了东亚钳蝎毒素多肽Marcin-18及其同源肽（Meucin-18和Megicin-18）的抗菌功能和作用机制。在上述研究中,根据Gen Bank上搜索到的Marcin-18的前体核苷酸序列（No.ADT89762.1）以及本课题组之前获得的东亚钳蝎基因组测序结果,在基因组和转录水平上都鉴定到了Marcin-18的存在,并利用蛋白质组学方法证实Marcin-18在东亚钳蝎的毒液中真实存在。蛋白质序列比对表明,Marcin-18与Meucin-18和Megicin-18具有极高的序列同源性,它们的ORF都编码一条由信号肽、成熟肽和前肽三部分组成的前体。螺旋轮结构预测显示,Marcin-18及其同源肽采用了一种两亲性的α-螺旋结构,螺旋轮的一侧为亲水（极性）氨基酸,另一侧为疏水氨基酸。圆二色谱分析进一步证实了这种结构,这三种化学合成多肽在水中呈现无规卷曲结构,在30%或70%的三氟乙醇水溶液中呈现α-螺旋结构。在体外,化学合成的Marcin-18及其同源肽对革兰氏阳性菌（包括一些临床耐药菌株）表现出较强的抑制活性。另外,这些多肽在0～250 m M Na Cl溶液中都保持了稳定的抗菌活性。Marcin-18和Megicin-18多肽在p H 3.0～5.0的酸性环境中仍然具有稳定的抗菌活性,但在中性和碱性环境中（p H 6.0～10.0）抗菌活性降低,而Meucin-18多肽对酸性、中性和碱性环境都有较强的耐受性。通过构建小鼠致死性腹膜炎模型,发现这些多肽有效保护了甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌严重感染的小鼠,并且显著降低了感染小鼠腹水中的菌落数,说明Marcin-18及其同源肽在体内仍然具有较好的抗菌活性。杀菌动力学实验结果显示这些多肽均能快速杀灭细菌;竞争性结合实验结果显示脂多糖和脂磷壁酸对这些多肽的抗菌活性没有显著影响;荧光动力学实验结果显示,这些多肽通过快速破坏细胞膜来杀死细菌;透射电子显微镜分析显示,多肽处理后的细菌细胞膜破裂,出现粒状细胞质,说明这些多肽通过杀菌机制发挥抗菌活性,通过破坏细胞膜来杀死细菌。最后,通过筛选本实验室前期构建的彼得异蝎的毒腺c DNA文库,发现了一条新的抗菌多肽Hp1473,并对其抗菌机制进行了探究。Hp1473的ORF编码一条由23个氨基酸的信号肽、13个氨基酸的成熟肽和32个氨基酸的前肽组成的前体。二级结构分析显示,Hp1473是一条两亲性的α-螺旋肽。在体外,化学合成的Hp1473多肽对革兰氏阳性菌（包括抗生素耐药的临床分离菌株）有抑制活性,它也能抑制白色念珠菌的生长。小鼠腹膜炎模型实验结果进一步验证了Hp1473多肽在体内仍然具有良好的生物学活性。杀菌动力学实验结果显示,在不同浓度的Hp1473多肽作用三小时的过程中,金黄色葡萄球菌的活菌数与起始菌落数相比并没有下降,说明Hp1473是一种抑菌肽,它可能拥有不同于现有蝎毒液来源抗菌多肽的作用机制。荧光动力学实验结果显示,在不同浓度的Hp1473多肽处理细菌三十分钟的过程中,反应体系的荧光强度并没有明显的变化,说明细菌的细胞膜未被Hp1473多肽裂解。透射电子显微镜和扫描电子显微镜分析显示,4×MIC浓度的Hp1473多肽处理后的细菌细胞呈现圆形,具有完整的细胞壁和细胞膜,说明Hp1473多肽不会破坏细菌细胞的超微结构。激光共聚焦显微镜分析显示,FITC-Hp1473多肽聚集在细菌细胞上的一个点。通过检测与多肽孵育后的重组蛋白Fts Z的GTPase活性,发现Hp1473多肽可能不与Fts Z相互作用。竞争性结合实验结果显示,随着脂多糖或脂磷壁酸浓度的升高,Hp1473多肽的抗菌活性逐渐减弱,说明Hp1473多肽可能有一个与细菌细胞壁相关的未知靶点。通过检测Hp1473多肽的溶血活性和在生理条件下的稳定性,发现Hp1473多肽在100μg/m L的浓度下能使55%左右的人红细胞裂解;与血清孵育后的多肽活性立即丧失,说明Hp1473多肽的血清稳定性较差;Hp1473多肽对酸性、中性和碱性环境都有较强的耐受性;Hp1473多肽对细菌的抑制活性在0～150 m M Na Cl溶液中保持稳定,当Na Cl浓度大于200 m M时,Hp1473多肽对细菌的最低抑制浓度会随着Na Cl浓度的升高而上升。综上所述,本研究加深了对蝎毒液来源抗菌多肽的基因组织结构的了解,为蝎毒腺抗菌多肽基因表达调控相关成分的鉴定奠定了基础,也丰富了蝎毒液的多肽成分信息。本工作也对东亚钳蝎毒液来源的抗菌多肽Marcin-18及其同源肽和从彼得异蝎中筛选的一条新的抗菌多肽Hp1473进行了功能解析和机制研究,为抗菌药物的开发设计提供了新的分子模板。