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薯蓣皂素是盾叶薯蓣的主要化学成分,可用于合成多种甾体激素类药物,在全球范围内需求量仅次于抗生素。从植物中提取分离是目前获得薯蓣皂素的唯一方式,但也不可避免的造成了植物资源的浪费和环境污染。利用微生物异源表达植物次生代谢的合成途径可在短时间内获得大量产物,已成为替代传统提取和化学合成的有效手段,但该技术基于对代谢物合成途径的充分认知。薯蓣皂素主要通过细胞质中甲羟戊酸途径（mevalonate pathway,MVA）合成,可能伴有质体中甲基赤藓醇磷酸途径（methylerythritol phosphate pathway,MEP）的参与,但其下游合成过程仍待解析。鉴于盾叶薯蓣基因组测序尚未完成,本文选择MVA途径的角鲨烯环氧酶（squalene epoxidase,SE）基因、环阿屯醇合酶（cycloartenol synthase,CAS）基因和MEP途径的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR）基因,利用基因克隆、亚细胞定位,原核表达、酶活分析和遗传转化等方法对基因功能展开研究,为薯蓣皂素合成的下游途径解析以及代谢调控提供了理论依据。利用RACE技术从盾叶薯蓣中克隆了DzSE基因,与已知的DzCAS和DzDXR进行生物信息分析。DzSE、DzCAS和DzDXR分别编码514、759和469个氨基酸,二级结构预测三种蛋白的柔性区域较少,几乎由α螺旋和β折叠构成,三级结构中的催化及结合位点与同源蛋白位置重合,说明这三种蛋白在进化过程中高度保守。亚细胞定位结果显示,MVA途径3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,DzHMGR）、角鲨烯合酶（squalene synthase,DzSS）、DzSE、DzCAS与GFP的融合的荧光信号与内质网重叠,法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,DzFPPS）分布在细胞质中,MEP途径DzDXR和2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合酶（2-C-Methy-D-erythritol2,4-cyclodiphosphate synthase,DzMDS）定位在叶绿体,这说明内质网对薯蓣皂素合成至关重要,可能为多步氧化修饰反应提供了场所。通过实时定量分析基因组织表达模式,结果显示三个基因在叶片中表达量最高,茎中次之,DzDXR在根状茎几乎不表达。HPLC测定不同生长时期不同组织皂素的含量,与相同条件下基因组织表达量进行综合分析,结果显示DzSE和DzCAS的表达与皂素含量变化正相关,推测薯蓣皂素主要在叶片合成,连接糖基后通过茎运输到根状茎中,同时根状茎也有一定合成薯蓣皂素的能力。用原核载体p Mal-c2x成功体外表达出与MBP融合的重组蛋白DzSE、DzCAS和DzDXR,大小分别为98.1 KDa、129.3 KDa和93.3 KDa。经过酶活性检测,DzSE具有体外催化角鲨烯合成2,3-氧化角鲨烯的酶活性,这一反应同时需要NADPH与P450细胞色素还原酶（NADPH-cytochrome P450 reductase,DzCPR）的辅助参与。加入DzCAS蛋白继续反应,但没有检测到环阿屯醇的生成,这可能由于部分真核基因在原核表达系统中不能保持生物活性。此外,制备了薯蓣皂素多克隆抗体来研究其在盾叶薯蓣组织中的分布和含量差异,抗体的效价达到1:16000,灵敏度63.43 ng/m L。免疫组化结果表明,叶片中薯蓣皂素含量明显高于根状茎,证明叶片是合成薯蓣皂素的主要器官。在细胞水平进行分析,发现呋甾皂苷的含量明显多于螺甾皂苷,并且螺甾皂苷主要存在于液泡和囊泡中,推测呋甾皂苷可能在细胞质中转化为螺甾皂苷,通过胞内囊泡运输到液泡中储存。通过农杆菌介导的方法将DzSE、DzCAS和DzDXR基因转化葫芦巴,获得了相应的过表达植株,并对转基因造成的代谢物差异进行了检测。在三个基因过表达植株中,胆甾醇、菜油甾醇、谷甾醇、豆甾-5烯和薯蓣皂素等甾醇类含量相比野生型均有不同程度的增加,DzCAS对甾醇合成的促进作用最显著,说明MVA和MEP途径都参与了薯蓣皂素生物合成,MVA途径占主导作用,DzCAS能定向调控代谢流向甾醇合成。DzDXR过表达促进了质体途径代谢物的合成,叶绿醇、新植二烯和生育酚等含量明显增加,但DzSE与DzCAS对质体途径代谢没有影响。盾叶薯蓣遗传背景复杂,转化效率依赖于合适的基因型。通过对盾叶薯蓣再生体系和转化条件的改良,利用CRISPR/Cas9编辑技术获得了一种DzDXR基因碱基缺失造成的移码突变体。对关键酶基因功能的综合研究有助于分析薯蓣皂素的来源与形成机制,也为下一步盾叶薯蓣分子育种提供了相关理论依据。