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【研究背景和目的】 研究表明，I型电压依赖型钠通道(Nav1.1)编码基因SCN1A为癫痫易感基因。SCN1A基因突变在热性惊厥附加症疾病谱致病机制中占有极其重要的地位，它与多种类型的热性惊厥附加症相关，包括GEFS+，PEFS+，SMEB及SMEI等。既往研究认为SCN1A基因截短突变几乎全部引起Dravet综合征，近年来有报道SCN1A基因截短突变引起较轻EFS+临床表型(PEFS+或GEFS+)。进一步分析截短突变与临床表型关系时发现，较轻EFS+表型携带的截短突变位置主要分布在距离起始密码子较近的地方，而在症状相对严重的DS患者携带的截短突变位置分布比较广泛。既往认为由于提前终止密码子出现导致蛋白截短，引起通道功能丧失，推测单倍剂量不足是SCN1A截短突变的致病机制。然而，有报道对同样来自DS患者的截短突变体R222X，R712X，R1245X，R1407X和R1892X的电生理功能研究，发现R222X，R712X，R1245X和R1407X引起LOF，而R1892X则可检测到部分电流（PLOF），这提示可能有其他因素参与致病机制。同时临床发现选择性钠离子通道阻滞剂对EFS+患者有致癫痫发作恶化加重可能，而且可能与其功能变化有关。由此对来自不同表型的NaV1.1截短突变体的分子表达与功能变化进行研究，并给予AEDs干预，寻找其可能致病机制以及与EFS+临床表型的相关性，以及判断不同EFS+患者对药物不同反应的可能机制。 【实验方法】 详细收集携带SCN1A基因截短突变的EFS+患者的临床资料及突变特点。以质粒pCMV-SCN1A-WT和PIRES-S4为模板，分别构建伴或不伴有融合表达EYFP的截短突变质粒（pCMV-MuSCN1A与pCMV-EYFP-MuSCN1A）。转染至HEK293-T细胞48小时后，分别进行激光共聚焦检测荧光表达分布情况及荧光定量；提取总蛋白（Input）与表面蛋白（Surface）进行膜蛋白水平定量检测，并加用AEDs干预观察膜蛋白表达水平的变化情况；同时进行全细胞膜片钳电生理功能检测。使用SPSS13.0软件包(SPSS lnc.，Chicago，IL，USA)进行统计分析，计量资料据以均数±标准误(X±SE)表示，成组设计多样本均数的比较用one-way ANOVA检验，p<0.05为差异具有统计学意义。细胞电生理学结果使用pCLAMP10.0、OriginPro8.0软件包作图。 【研究结果】 1、所有的1030例热性惊厥及热性惊厥附加症患者中发现14例患者携带有SCN1A截短突变，其中DS12例（85.7％），PEFS+2例（14.3%），共携带有13个不同位置截短突变，其中PEFS+患者截短突变位置主要分布在距离起始密码子较近的位置。 2、通过酶切和测序证实，成功构建了pCMV-Mu SCN1A与pCMV-EYFP-Mu SCN1A截短突变质粒。 3、电生理检测发现S662X与F1237fsX1269截短突变体未检测到钠电流，为完全功能缺失（LOF）；而V1761fsX1793、L1849fsX1861与 R1874fsX1944等三个距离SCN1A起始密码子更远的突变体可检测到部分电流，表现为电流密度下降，激活速度变慢，更容易失活，快复活速度减慢，功能缺陷表现为钠通道部分功能丧失（pLOF）。 4、激光共聚焦显微镜检测发现，Nav1.1野生型黄色荧光蛋白在胞浆中分布相对均匀，在内质网区无明显堆积现象；而Nav1.1截短型黄色荧光蛋白在胞浆中主要堆积滞留在内质网区，内质网结构显示含糊不清。在HEK293-T细胞膜上，Nav1.1截短蛋白显示的黄色荧光明显减弱，统计分析发现Nav1.1截短突变体细胞膜荧光表达水平较野生型通道减少，具有统计学差异；进一步分析不同表型荧光表达水平，发现来自于PEFS+患者的截短突变体荧光表达水平明显低于SMEI，有显著差异。 5、蛋白免疫印迹检测发现，除M145fsX148截短蛋白之外，Nav1.1野生型及其他截短蛋白都可在胞浆及胞膜上表达，Nav1.1截短突变体蛋白在细胞膜上表达水平与野生型相比明显减少，有统计学意义。S662X截短蛋白在细胞膜上表达水平与W280X，V1761fsX1793与R1874fsX1944等来自SMEI患者的截短蛋白在细胞膜上的表达水平相比明显减少，具有统计学显著差异；进一步分析不同表型膜蛋白表达水平，发现来自于PEFS+患者的截短突变体膜蛋白表达水平明显低于来自于SMEI患者。 6、应用AEDs干预处理，发现VPA与TPM能增加Nav1.1野生型蛋白在HEK293T细胞膜上的表达水平，TPM也能增加V1761fsX1793膜蛋白表达水平；PHT与LTG干预对野生型及截短蛋白影响呈一致趋势，其使V1761fsX1793膜蛋白表达水平增高，R1874fsX1944膜蛋白表达水平降低，但对Nav1.1野生型与F1237fsX1269，L1849fsX1861膜蛋白表达水平无明显影响。 【结论】 1、SCN1A基因截短突变主要发生在 DS患者，也可在表型相对较轻的 PEFS+患者中出现；与 DS患者相比，PEFS+患者截短突变位置主要分布在距离起始密码子较近的位置。 2、SCN1A基因截短突变能通过ERAD机制减少截短蛋白在细胞膜上表达水平；不同长短的Nav1.1截短蛋白触发ERAD作用的程度不同，差异可能与其结构域保留的N-联糖基化位点有关。 3、Nav1.1截短突变体膜蛋白表达水平变化，与EFS+表型轻重有关。 4、抗癫痫药物可能通过影响蛋Nav1.1蛋白表达而发挥作用；促使野生型膜蛋白表达水平增高可能是非选择性钠通道治疗癫痫作用机制之一，而单一钠离子通道阻滞剂对截短蛋白表达水平的影响，对解释AEDs是否加重EFS+癫痫发作尚没有一致结论。