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目的: 1.制备阳离子脂质超声造影剂(Cationic ultrasound contrast agent,C-UCA)和磁性脂质超声造影剂(Magnetic ultrasound contrast agent,M-UCA),并对其性能进行验证; 2.运用超声联合C-UCA方法转染增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP),探讨C-UCA存在时的最佳转染参数; 3.将超声、C-UCA与聚乙烯亚胺(Polyetherimide,PEI)相结合,探讨三者协同增强Survivin-miRNA转染、诱导肿瘤细胞凋亡的可行性。 方法: 1.通过机械振荡法、薄膜水化-声振法以及薄膜水化-机械振动法制备具有阳离子性质的C-UCA及M-UCA,对制备的影响因素进行优化,并对C-UCA、M-UCA进行理化性质检测、形貌表征及体外性能验证。选取较合适参数制备C-UCA,较优的方法用于后续的基因递送研究中。 2运用已经优化的超声参数,对超声联合C-UCA转染pEGFP时的C-UCA浓度、质粒质量、细胞密度、培养基含血清与否和不同转染方式等进行优化,荧光显微镜下观察细胞的转染情况,流式细胞术测定其中一组的转染率,CCK-8实验检测转染后细胞的活力,筛选出最佳的转染参数。 3.将超声、C-UCA与PEI相结合介导Survivin-miRNA转染至Hela细胞,实验分为6组:质粒组(P组)、PEI+质粒组(PEI+P组)、超声+质粒组(US+P组)、超声+C-UCA+质粒组(UTMD+P组)、超声+C-UCA+PEI+质粒组(UTMD+PEI+P组)、空白组,通过倒置显微镜观察不同处理方式对细胞的影响,流式细胞术测定凋亡率,CCK-8实验测定转染后细胞活力。 结果: 1. C-UCA、M-UCA的制备优化及体外性能验证。 比较机械振荡法、薄膜水化-声振法和薄膜水化-机械振动法制备 C-UCA,发现采用机械振荡法和薄膜水化-机械振动法制备的效能更高。与薄膜水化-声振法相比,二者制备的C-UCA浓度更高,粒径更小,分布也更加均匀。采用最优方法制备的 C-UCA粒径<1μm,浓度为1~10×109个/ml,分散性良好;将制备好的样品室温下放置4h,稳定性良好,4℃条件下可延长至1个月。其中,阳离子脂质含量为15%的C-UCA的基因携载量最高可达70%。随着C-UCA浓度的增加,Hela细胞生存率呈现一定的变化。当 C-UCA在20%浓度时其细胞活力为(88.6±3.4)%,与对照组和浓度为1%时比较,细胞活力显著降低(P<0.05)。体外造影结果显示,C-UCA回声均质,后方未见明显衰减。将其稀释2000倍后,仍可以见到较为细腻的回声。 本研究还通过不同方法制备了M-UCA,其粒径和浓度较C-UCA差,但分散性良好,其室温下稳定性同C-UCA。基因携载量较C-UCA有所下降(27.65%)。M-UCA的浓度对Hela细胞的生存率也有一定的影响,随着浓度的增加,Hela细胞生存率下降。当M-UCA浓度为20%时,其细胞活力仅为(59.81±7.56)%。体外造影结果显示 M-UCA具有较好的体外造影能力。尽管如此,但是 M-UCA无论是在浓度、均一性、还是基因携载率和细胞毒性方面,均比C-UCA相差较远,有待进一步优化。因此,为了保证后续研究的顺利进行,本研究中选用了性能较好的C-UCA进行转染参数优化及凋亡实验的研究。 2.在前期优化超声参数(1MHz、20%DC、1W/cm2、1min)的基础上,经过一系列实验,确定最优的C-UCA浓度(5%)、质粒浓度(15μg)、细胞密度(1×106个/孔)、培养基(无血清)为最优参数,用于以下的研究中。 3. PEI+P组和UTMD+P组可显著诱导细胞凋亡,AI分别为39.4%、27.2%,显著优于其他各组(P<0.05)。RT-PCR结果表明,PEI+P组与UTMD+P组时的Survivin mRNA抑制率明显高于其他组的时,差异均有统计学意义(P<0.05)。通过转染后,各实验组细胞活力均有明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中,UTMD+PEI+P组的细胞活力[(48.27±12.24)%]显著低于其他各组,差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1.本研究采用机械振荡法、薄膜水化-声振法和薄膜水化-机械振动法制备了C-UCA和M-UCA,并对其外形、粒径及稳定性基因携载能力、细胞毒性,发现C-UCA更适用于联合超声介导的基因转染研究中。此外,C-UCA和M-UCA都具有较好的回声反射信号,为超声造影剂提供了一种新的尝试。 2.经过优化后的参数,在一定程度上可提高超声联合 C-UCA的转染效率,但其转染效率仍低于PEI。 3.单独使用PEI或超声联合C-UCA均可转染Survivin-miRNA,有效诱导肿瘤细胞凋亡,但二者的协同作用不明显。相反,超声、C-UCA及PEI联合使用会显著降低UTMD和PEI的转染效率,其具体机制有待进一步研究。