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Neuregulin（NRG）家族的基因有四个，其中NRG-1在神经、心脏和乳腺等系统或组织中发挥重要的作用。rhNRG-1（recombinant human NRG-1）激活心肌细胞上的ErbB2／4受体后，能改善心梗大鼠的心功能，但其机制尚不够清楚。本课题通过基因芯片筛选，并经过Real time PCR、Western blot验证后，发现rhNRG-1能增加一个预测的基因的表达：Similar to Myosin light chain kinase 2，skeletal／cardiac muscle（MLCK2）（GenBank accession number XM214645）。采用Northern、Western blot和Immunofluorescence等方法，证明该基因特异性分布于心肌细胞，并进一步证明它能使mlc-2v（Myosin light chain-2，ventricular）磷酸化，说明它是心肌特异性的MLCK，干扰其RNA表达后，rhNRG-1恢复受损心肌细胞的作用消失。初步证明rhNRG-1能增加心肌细胞特异性MLCK的表达，从而改善心功能。本课题共分五个部分：第一部分rhNRG-1能改善心梗大鼠的心功能。结扎大鼠冠状动脉前降支，建立心梗模型，根据EF值（左室射血分数）随机分为rhNRG-1治疗组、赋形剂对照组，连续静脉滴注rhNRG-1（10μg／kg／2hx7天）或同等体积赋形剂，于用药前、后分别进行心超检测。同步设立假手术组：开胸但不结扎冠状动脉，也不给予任何药物。结果：用药后rhNRG-1组LVEDD（左室舒张末内径）、LVEDS（左室收缩末内径）、EF、FS（左室缩短分数）分别为9.46±0.20mm、7.62±0.23mm、44.7±1.9％、19.8±1.1％，与赋形剂组相比，LVEDD、LVEDS分别下降了9.1％、18.8％，而EF、FS分别升高了62.5％、75.1％（P＜0.01，n＞10）。证明rhNRG-1能改善心梗大鼠的心功能。第二部分大鼠心肌基因芯片检测及相关验证表明：rhNRG-1能使Similar RLCK表达增加。1．基因芯片检测：选取第一部分实验动物的左室非梗区，每组取3只，独立提取RNA，共9份RNA样品，分别与9张基因芯片杂交（Rat Genome 230 2.0 Arrays, Affymetrix）。结果提示，rhNRG-1能增加一个预测基因的表达：Similar to Myosin light chain kinase 2, skeletal/cardiac muscle（MLCK2）（GenBank accession number XM214645）。当假手术组标化为1.000时，赋形剂组为0.677，而rhNRG-1组为1.652，rhNRG-1／赋形剂比值为2.441，有统计学差异（P＜0.01，n=3）。2．Real time PCR和Western blot验证了基因芯片的结果：Similar MLCK N端1400bp是特异性的片断，故选取1018-1317片断，采用Real time PCR验证了其基因变化。选用487-885片断，构建Similar MLCK-GST／pGEX-2T质粒，表达similar MLCK（487-885）-GST融合蛋白，免疫兔子获得高效价抗体，进行Western blot验证了其蛋白水平的变化。结果与基因芯片的结果相吻合，证明rhNRG-1确实增加了该基因的表达。第三部分大鼠Similar MLCK特异性分布于心肌细胞1．Northern blot：选取Similar MLCK 238-885片断作为探针，用α-32PdCTP标记后，与大鼠多种组织northern杂交膜进行杂交，结果只在心肌组织中有单一的条带（约4.3kb）。2．Western blot：采用第二部分试验中制备的similar MLCK抗体，与大鼠多种组织蛋白进行杂交，结果发现similar MLCK只在心肌组织中表达（约86kd）。3．Immunofluorescence：新生大鼠原代心肌细胞未纯化培养后免疫荧光染色发现：similar MLCK只分布于心肌细胞，smooth MLCK分布于心肌组织内的平滑肌细胞。成年大鼠心脏冰冻切片免疫荧光显示：similar MLCK分布于心肌细胞，而smooth MLCK分布于血管组织。综合上述结果，可以证实：similar MLCK特异性分布于心肌细胞。第四部分大鼠Similar MLCK能使MLC-2v磷酸化，是心肌特异性MLCK。构建大鼠cardiac MLCK／pCDNA3表达质粒，转染cos7细胞后，收集细胞裂解液作为cardiac MLCK的来源，加入体外反应体系(含有MLC-2V，以及Ca2+，CaM，ATP等物质)，观察mlc-2v的磷酸化。结果表明：Cardiac MLCK能使mlc-2v磷酸化且必须依赖Ca、CaM的存在。Cardiac MLCK用量相同时，随着作用时间的延长，mlc-2v磷酸化水平越高，20min时能检测到磷酸化，100min时基本达到饱和。在相同作用时间下，随着Cardiac MLCK用量的增加，mlc-2v磷酸化水平越高。作用时间相同、Cardiac MLCK用量一样时，不同温度下mlc-2v磷酸化无明显变化。特异性分布于心肌细胞的Similar MLCK能使MLC-2v磷酸化，且有明显的量效和时间关系，证实了similar MLCK是心肌特异性MLCK。第五部分rhNRG-1通过增加cardiac MLCK的表达而改善心功能。1．筛选有效的cardiac MLCK RNA表达干扰片段：针对cardiac MLCK CDS区156-174（GCTACAGTGTGTGTGCCAA）等片断，构建RNAiⅠ，Ⅱ，Ⅲ质粒（pRNAT-CMLCK-Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ），然后分别与cardiac MLCK／pCDNA3表达质粒，共同转染cos7细胞，用Western blot检测cardiac MLCK的变化。结果：RNAiⅠ，Ⅱ，Ⅲ质粒分别使cardiac MLCK的表达下降80％，50％，20％，提示RNAiⅠ质粒干扰效果最好。2．rhNRG-1通过增加cardiac MLCK的表达而改善心肌细胞的结构：干扰或对照质粒转进心肌细胞后，会有GFP绿色荧光，借助α-actinin染色能显示心肌细胞的横纹结构，通过图像分析系统将横纹紊乱的面积分为不同等级：Area＜25％，25％≤area＜50％，50％≤area＜75％，area≥75％，统计各级细胞数量，分析比较各组横纹结构的变化。结果：正常、正常+RNAiⅠ、无血清+对照质粒、无血清+对照质粒+rhNRG-1、无血清+rhNRG-1+RNAiⅠ组内，紊乱面积≥50％的细胞分别为2％、80％、60％、28％、80％。说明cardiac MLCK的表达受干扰后，正常细胞的横纹排列紊乱；无血清培养能使心肌细胞横纹排列紊乱，rhNRG-1能恢复紊乱的横纹；Cardiac MLCK表达被干扰后，rhNRG-1恢复紊乱横纹的作用消失。说明rhNRG-1可通过增加cardiac MLCK的表达而恢复心肌细胞的结构，进而改善心功能。结论：1．Similar MLCK（GenBank accession number XM214645）可称作Cardiac specific MlCK，这是一个新的MLCK的发现。2．rhNRG-1能改善心梗大鼠的心功能。3．rhNRG-1能使Cardiac specific MLCK表达增加。4．Cardiac MLCK表达被干扰后，rhNRG-1恢复受损心肌细胞的作用消失。5．rhNRG-1增加cardiac MLCK的表达，从而改善心肌收缩功能。潜在价值和创新点：1．Similar MLCK（GenBank accession number XM214645）可称作Cardiac specific MlCK，这是一个新的MLCK的发现，可作为新的药物靶点，筛选有效的增强心肌收缩的药物。2．rhNRG-1能改善心梗大鼠的心功能，并增加Cardiac specific MLCK的表达。3．rhNRG-1恢复受损心肌的作用必须依赖Cardiac MLCK。