论文部分内容阅读
[目的]:美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweedantiviralproteins，PAPs)是在美洲商陆(phytolaccaamercana)的不同组织或不同生长阶段合成的一类具有酶功能的核糖体失活蛋白(ribosome-inactivatingproteins，RIPs)，有多种类型，即PAP-Ⅰ，PAP-Ⅱ，PAP-Ⅲ，PAP-S，PAP-R，分别来自春天的叶片、初夏的叶片、晚夏的叶片、种子、根。美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ(pokeweedantiviralproteinⅡ)，具有RNAN-糖苷酶的活性，能专一地从真核生物核糖体28SrRNA的第4324位和原核生物核糖体23SrRNA的第2600位切下一腺嘌呤，干扰延伸因子EF-2催化GTP的水解，从而阻碍了蛋白质的合成。最近的研究表明PAP-Ⅱ蛋白能抑制HIV病毒在内的多种病毒，也有研究将其构建成免疫毒素，用于杀伤肿瘤细胞。本实验室利用基因工程方法，从新鲜的美洲商陆夏季的叶片中成功的克隆了PAP-Ⅱ的基因，插入到原核表达载体，并在大肠杆菌BL21中成功地表达了PAP-Ⅱ蛋白，为进一步研究PAP-Ⅱ的抗病毒、抗肿瘤的作用机理提供研究平台。
[方法]:根据报道的cDNA序列，设计合成两条引物，在两条引物上分别添加HindⅢ、NdeⅠ酶切位点，用RT-PCR的方法从夏季的美洲商陆新鲜的叶片中克隆PAP-Ⅱ基因，与T载体连接，连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，经过NdeⅠ和HindⅢ双酶切鉴定阳性亚克隆，送生工测序。对确定含有PAP-Ⅱ基因的阳性亚克隆，用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ对阳性亚克隆产物双酶切，目的基因片段切胶回收，与经相同酶切的pET-28a-c(+)载体连接，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，挑选阳性克隆，小量表达鉴定重组表达质粒。将含有正确表达质粒pET-PAP-Ⅱ的转化菌BL21(DE3)用IPTG诱导表达，收集菌体沉淀，重悬超声破菌，将超声所得沉淀反复洗涤，8M的尿素溶解包涵体，透析复性。复性蛋白溶液用BBSTNTA树脂亲和层析纯化，经SDS-PAGE电泳检测，用非放射性基于ELISA方法检测经过复性纯化后PAP-Ⅱ蛋白和蓖麻毒素A链(RTA)在体外对HIV-1整合酶的抑制活性，用MTT法检测PAP-Ⅱ蛋白对HEP-G2和Hela细胞毒性。
[结果]:RT-PCR产物与预计的目的片段长度大小一致。RT-PCR产物与T载体连接产物转化感受态JM109，抽提质粒用NdeⅠ和HindⅢ双酶切确认阳性质粒，经测序证实该片段序列与所报道的序列完全一致。
重组表达质粒pET-PAP-Ⅱ用NdeⅠ和HindⅢ双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳。可见有目的条带片段，说明PAP-Ⅱ的编码基因已插入pET-28a-c(+)。含重组表达质粒pET-PAP-Ⅱ的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达，在表达的过程中发现BL21(DE3)细菌的生长明显受到抑制。表达后的菌液及菌体超声破菌后沉淀和上清12％SDS-PAGE电泳，经诱导菌液泳道及超声沉淀泳道均可见一分子量约为35kD的蛋白条带，而未诱导菌液与超声上清无相应条带，这说明PAP-Ⅱ蛋白以包涵体形式正确表达。包涵体反复洗涤后，用8M尿素溶解，透析复性所得产物，经BBSTNTA树脂纯化，SDS-PAGE检测，结果显示其纯度较高。用非放射性基于ELISA方法检测经过复性纯化后PAP-Ⅱ蛋白和蓖麻毒素A链(RTA)在体外对HIV-1整合酶有较强的抑制活性，其IC50分别约为303μg/ml，220μg/ml。用MTT法分析PAP-Ⅱ蛋白的生物学活性，复性纯化后蛋白对HEP-G2和Hela细胞有细胞毒作用，IC50分别为93μg/ml，102μg/ml，说明了PAP-Ⅱ蛋白能抑制肿瘤细胞的生长。
[结论]:本研究成功地构建了PAP-Ⅱ的表达系统，所表达的蛋白经复性后具有生物学活性，为进一步研究PAP-Ⅱ的抗HIV-1机制和抗肿瘤作用奠定了基础。