【摘 要】
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背景:静脉移植再狭窄（Vein graft failure,VGF）与血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell,VSMC）的增殖和迁移与表型转换密切相关。在移植动脉模型中我们可以观察到主要的病理机制包括VSMC由收缩（分化）型向增殖（合成）型转变的表型转换。在细胞实验中如何诱导VSMC的表型转换,是为研究血管重塑性疾病的细胞病理学基础。血小板源性生长因子（Platel
【基金项目】
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万力主任医师国家自然科学基金课题“14-3-3γ-PCNA交互作用在VSMC增殖与凋亡中的功能与机制研究”（№:81860082）；
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背景:静脉移植再狭窄（Vein graft failure,VGF）与血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell,VSMC）的增殖和迁移与表型转换密切相关。在移植动脉模型中我们可以观察到主要的病理机制包括VSMC由收缩（分化）型向增殖（合成）型转变的表型转换。在细胞实验中如何诱导VSMC的表型转换,是为研究血管重塑性疾病的细胞病理学基础。血小板源性生长因子（Platelet-derived growth factor,PDGF）是一种强效促有丝分裂剂,是参与介导VSMC增殖和其内膜增生的重要因素之一。其中,PDGF-BB（Platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB）为VSMC增殖和迁移最有效的刺激剂。目的:研究miR-200a-3p在对PDGF-BB诱导的VSMC表型转换状态下相关表型蛋白及细胞增殖凋亡的影响。方法:（1）选用大鼠主动脉平滑肌细胞（A7R5细胞）,用浓度为0（Control组）、2.5、5、10、20、40 ng/ml的PDGF-BB构造VSMC表型转换模型,通过western blot检测相关表型转换蛋白,划痕实验检测细胞迁移,CCK-8,EDU实验检测细胞的增殖,进一步筛选PDGF-BB的最适浓度。（2）构建Control组和PDGF-BB组,分别提取总RNA,根据数据库筛选的miRNAs,进行逆转录和q RT-PCR,检测miRNAs之间的差异表达。（3）对所选择的差异miRNAs进行干扰,转染48h后分别得到空白组,miRNA空载组,miR-200a-3p mimic组。通过western blot检测表型相关蛋白平滑肌肌动蛋白α（α-sma）,细胞波形蛋白（Vimentin）,基质金属蛋白酶2（MMP2）及细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、CCK-8实验,EDU实验,流式细胞学实验检测各组之间细胞增殖和凋亡的状态进行验证。结果:（1）与Control组相比,浓度为2.5、5、10、20、40 ng/ml的PDGF-BB诱导下VSMC表型相关蛋白均有变化,细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）与PDGF-BB浓度的呈正相关的表达。当PDGF-BB浓度为20ng/ml时,VSMC表型相关蛋白及细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）与Control组有明显差异,细胞迁移和增殖能力显著增强,促进了VSMC表型的转换。（2）通过PCNA、14-3-3γ蛋白相交,在不同种属中进行差异筛选,得到miR-23a-3p、miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-221-3p、miR-222-3p序列。q RT-PCR中显示与Control组相比,PDGF-BB诱导下的VSMC中miR-200a-3p显著下调（P＜0.0001）（3）与Control相比,PDGF-BB诱导的PCNA、14-3-3γ蛋白均发生上调,miR-200a-3p虽然没有改变PCNA、14-3-3γ相关的表达,但表型相关蛋白中收缩相关蛋白平滑肌肌动蛋白α（α-sma）,细胞波形蛋白（Vimentin）均有明显改变。CCK-8实验表明miR-200a-3p能够抑制PDGF-BB诱导的细胞增殖,在EDU实验中miR-200a-3p mimic组S期细胞较PDGF-BB组明显减少,流式细胞学显示miR-200a-3p mimic组较PDGF-BB组细胞凋亡无明显改变。结论:PDGF-BB诱导了VSMC的表型转换,促进了VSMC的增殖和迁移能力。miR-200a-3p的表达在PDGF-BB诱导的VSMC中明显的下调,上调miR-200a-3p后抑制了PDGF-BB诱导的VSMC表型转换,减缓了细胞的增殖。
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