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长期以来,由于受研究思路、技术水平等多种因素限制,气虚血瘀证生物学基础研究仍处于艰难探索阶段。其中,中医临床与现代生物学研究模式的差异是其主要原因之一,导致相关生物学指标研究缺乏与气虚血瘀证相关联的评价标准,影响了其科学性和客观性的评价。总结气虚血瘀证生物学基础既往研究中的经验与不足,973课题组提出了“因、脉、证、治”的建模思路和气虚血瘀表征模型的概念,以此为依据,本课题对气虚血瘀大鼠模型宏观表征及部分生物学指标进行了研究,探讨气虚血瘀证生物学基础研究的客观评价方法。目的:1探讨在中医理论指导下的气虚血瘀动物模型制作方法;2探索气虚血瘀动物模型宏观表征研究与评价方法;3部分揭示气虚血瘀证微观生物学基础;4探索气虚血瘀证生物学基础研究的客观评价方法。方法:1实验研究(1)根据“劳则耗气”中医理论,从病因角度入手,以力竭游泳为造模手段,建立游泳→力竭气虚→气虚血瘀的动物模型,确定气虚血瘀动物模型的制作方法;选取不同的时间点(1w、2w、4w),从外观状况、体重、平均进食量、游泳时间、精神状态评分、排便情况、舌质评分、复合电生理检测、行为学检测、舌图照相等方面对模型大鼠宏观表征进行动态观察,筛选模型大鼠能够反映气虚血瘀特征的敏感宏观表征。(2)动态观察(1w、2w、4w)模型大鼠血浆葡萄糖(glucose,GLU)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceriche,TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)及血黏度、红细胞变形及聚集指数、凝血相关指标等的变化,从能量代谢及血液流变学改变角度探讨气虚血瘀证生物学基础。(3)用黄嘌呤氧化酶法测定心、脑组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD);用硫代巴比妥酸法(thibabituric acid,TBA)测定心脑组织丙二醛(malondialdehyde,MDA);用硝酸还原酶法检测心、脑组织一氧化氮(nitric oxide,NO);用放射免疫法检测心、脑组织内皮素(endothelin,ET)、血浆肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、血浆白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),从氧化应激损伤、血管活性物质失衡、组织炎性损伤等角度探讨气虚血瘀证生物学基础。2宏微观指标多元分析研究在实验研究的基础上,运用典型相关分析方法,分析敏感表征与其它表征及微观指标的相关性;对与敏感表征相关度较高的微观指标进行判别分析,筛选敏感微观指标,探索气虚血瘀生物学基础研究的客观评价方法。结果:1实验研究1.1气虚血瘀模型大鼠表征研究外观状况:表现出无精打采、眼微睁、无神、自主活动少、对外界反应迟钝,被毛黯淡枯燥,爪甲色淡等特征;体重:模型组大鼠体重增长缓慢,模型2w、4w组的体重均显著低于正常组(P<0.05);平均游泳时间:模型2w、4w组比模型1w组明显缩短;精神状态评分:模型组大鼠精神状态评分增高,模型2w、、4w组与正常组相比有显著性差异(P<0.05);旷场分析:模型2w及4w组大鼠中央格停留时间较正常组有所延长(P<0.05);舌质:模型组大鼠在造模1w后舌质由淡红转为紫黯,模型1w、2w、4w组与正常组相比较均有显著性差异(P<0.05),且其分值随游泳时间延长逐渐增高。1.2气虚血瘀模型大鼠能量代谢及血液流变学研究能量代谢指标:模型1w、2w、4w组血糖水平增高,与正常组相比有显著性差异(P<0.05);模型4w组TC、TG水平下降,与正常组相比有显著性差异(P<0.05)。血液流变学指标:模型组2w组血浆黏度增高,与正常组相比有显著性差异(P<0.05);模型1w、2w组红细胞聚集指数降低,与正常组相比有显著性差异(P<0.05);模型1w、2w组凝血酶原时间(prothrombin time ,PT)缩短,与正常组相比有极显著性统计学意义(P<0.01),模型4w组PT及部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time ,APTT)缩短,与正常组相比有显著性差异(P<0.05);模型4w组纤维蛋白原(fibrinogen,Fbg)水平较正常组有所降低,与正常组相比有显著性差异(P<0.05)。1.3气虚血瘀模型大鼠心、脑组织损伤机制研究模型组大鼠心肌组织MDA含量升高,与正常组相比有显著性差异(P<0.05);模型组大鼠心肌组织ET水平升高,与正常组相比有显著性差异(P<0.05);血浆TNF-α、IL-1β的检测中未见明显变化(P>0.05)。2宏微观指标多元分析研究在敏感表征与宏观表征的典型相关分析中,气虚表征之间有较高的相关度,反映了模型大鼠从体重变化到精神状态及生活习性的一致性,而游泳时间与中央格为负相关,反映了运动能力的降低与生活习性变化相一致。血瘀表征“舌质”主要与“精神状态”有较高相关性,侧面反映了血瘀表征与气虚表征有一定相关性。敏感表征与其余表征相关程度较低,进一步验证了气虚血瘀敏感表征的特异性。在敏感表征与微观指标的典型相关性分析中,与气虚表征有显著相关性(P<0.05)微观指标为:①能量代谢指标:GLU、TG;②血液流变学指标:VIS10、VIS60、AGGRE;③氧化应激相关指标:SOD2;④血管调控物质相关指标:ET1、ET2、NO1;⑤IL-1β。与血瘀表征有显著相关性(P<0.05)的微观指标为:PT、APTT、LDL、TNF-α。在此基础上,对与气虚血瘀敏感表征较为相关的微观表征作了判别分析研究。判别分析结果显示,在以上诸多指标中PT与APTT两项指标贡献度较大,并得出了相关变量的非表准化判别函数为“y=-23.979+1.287PT+0.327APTT”。可以根据判别函数计算每个观测样本的判别Z得分,从而判别其归属。通过验证性分类检验,证明判别函数具有较高的准确程度。结论:1气虚血瘀证表征模型研究模型大鼠在力竭游泳后表现出精神状态差、体重下降、游泳时间缩短、旷场分析中央格时间延长、短暂的排便增多等表征,分别与气虚证的倦怠、消瘦、乏力、懒动、便溏等证候特征相应,为反映气虚的敏感表征;舌质的紫黯为反映血瘀的敏感表征。相关敏感表征以造模4w时最为典型。以上敏感表征的确立证明力竭游泳法复制的气虚血瘀动物模型符合中医理论特征,相关表征可以反映气虚血瘀证部分临床特征。2气虚血瘀证生物学基础研究能量代谢与血液流变学改变是气虚血瘀证重要的生物学基础;脂质过氧化损伤及血管调控失常是气虚血瘀模型大鼠器官损伤的重要病理机制;本模型中无明显的炎性反应。由此得出模型大鼠组织器官损害并不显著,与模型大鼠无定位性组织器官损害的宏观表现相一致。3气虚血瘀证微观生物学指标研究的评价通过对敏感表征与宏微观表征的典型相关分析及判别分析,在所检测微观指标中,PT、APTT两项指标对气虚血瘀模型的贡献度较大,可以作为判定气虚血瘀的微观敏感指标。本项研究证实在气虚血瘀动物模型表征研究基础上,对气虚血瘀证微观生物学指标进行客观评价是科学可行的。