神经干细胞的诱导分化是当前神经发育领域的研究热点之一。神经干细胞向神经元细胞诱导分化模型的构建,不仅简化了神经细胞分化分子机制的研究,对神经系统疾病的治疗也提供了新的思路。KLF4是调节细胞增殖与分化的重要转录因子,也是诱导体细胞进行重编程的四个关键因子之一。研究表明,KLF4能维持神经干细胞的自我更新和多潜能性,抑制其分化。同时,KLF4的功能失调会导致神经系统发育失常,提示KLF4在调节神经系统的正常分化中发挥了关键作用。鉴于KLF4在神经细胞发育过程中起到的重要调节作用,我们以KLF4启动子为靶点进行其表达调节剂的筛选,以期发现能够有效促进神经细胞发育的中药小分子化合物。通过药物筛选所确定的目标化合物能够有效地抑制KLF4启动子活性,并通过免疫印迹等实验手段证实目标化合物能够促进神经干细胞向胆碱能神经元细胞进行分化。主要结果如下。1.构建了 KLF4真核表达载体。通过RT-PCR法扩增了 KLF4的编码序列,并将其连接入pcDNA3中,构建了 pcDNA3-KLF4真核表达载体。2.构建了 KLF4启动子的荧光素酶报告载体。将钓取的KLF4启动子区序列连接入pGL3-basic载体,构建了 pGL3-KLF4荧光素酶报告载体。通过荧光素酶活性检测,结果证实该启动子有较高的转录活性。3.KLF4中药小分子表达抑制剂的筛选。利用KLF4启动子荧光素酶报告系统对本实验室的中药小分子库进行筛选,发现CA21、CA71、CA93及CA95对KLF4的表达有抑制作用,并从蛋白水平进行了验证。4.重点研究了 CA71对KLF4表达的抑制作用,并对其诱导胆碱能神经元细胞分化作用进行了初步研究。免疫印迹分析结果表明,KLF4抑制剂CA71可促进胆碱能神经元细胞分化,且此作用与Wnt/β-catenin信号下调有关。