论文部分内容阅读
背景和目的:琥珀酸脱氢酶亚基 A(succinate dehydrogenase complex subunit A,SDHA)是组成號珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)的亚基,属于线粒体蛋白,参与三羧酸循环和线粒体呼吸链的电子传递,在细胞能量代谢中发挥重要作用。已有研究表明,SDHA基因的突变与一种严重的致死性神经遗传病——雷吉氏综合征(Leigh Syndrome)有关。并且在野生型胃肠间质细胞瘤(wild-type gastrointestinal stromal tumors,WT-GIST)、肾肿瘤(renal tumors)、副神经节瘤(Paraganglioma)、嗜铬细胞瘤(Pheochromocytoma)、甲状腺瘤(thyroid tumors)等疾病中也发现了 SDHA基因的缺陷或表达异常,这些研究显示SDHA蛋白的稳定性调节紊乱与神经及多种肿瘤疾病的发病密切相关,而SDHA蛋白稳定性的调节机制还未见报道。有临床研究发现,SDHA功能缺陷患者多累及能量代谢旺盛的器官,如脑、肌肉仍然是主要受累脏器。肝脏作为人体重要的能量代谢器官,其线粒体功能正常对于维持肝脏正常的生理功能及肝细胞的生长发育尤为重要,但SDHA在其中发挥什么作用尚未见明确报道。小鼠胎肝来源的肝细胞系BNL CL.2常用来进行肝细胞功能的研究,本课题首先在BNL CL.2细胞中通过RNA干扰技术敲低Sdha基因的表达,探讨其对肝细胞生物学功能的影响,拓展了关于SDHA对小鼠肝细胞功能重要性的认识。类泛素化修饰Neddylation是近年来蛋白翻译后修饰领域的研究热点,被证实参与众多的细胞内的调控过程,如细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖与分化、炎症、DNA修复以及应激反应等。Neddylation的主要通路包括NEDD8前体的活化,被E1(UBA3-APPBP1)激活,与E2(Ubc12)结合,经E3催化连接到底物的Neddylation过程以及相反的去Neddylation过程。我们课题组前期工作发现SDHA是Neddylation的潜在底物,本课题通过进一步的实验研究来验证SDHA能否发生Neddylation修饰,并探讨修饰对SDHA的调控作用,从而揭示SDHA蛋白的稳定性调节机制。方法:1.在BNL CL.2细胞中通过慢病毒介导的shRNA干扰技术敲低Sdha基因的表达,观察Sdha基因敲低前后,细胞增殖速度的改变、细胞周期中各期细胞百分率的变化以及细胞凋亡率的变化。2.在BNL CL.2细胞中共转Flag-NEDD8和Myc-SDHA质粒,免疫沉淀结合Western蛋白印记法检测外源SDHA的Neddylation修饰情况;分别在野生型(WT)小鼠和UBA3基因敲除型(KO)小鼠的肝细胞中通过免疫沉淀结合Western蛋白印记法考察内源SDHA 的 Neddylation 修饰。3.为了依次保留SDHA蛋白其中一个结构域的赖氨酸,而将其他三个结构域中的赖氨酸突变为精氨酸,构建了四个Sdha基因突变体质粒(Mutl、Mut2、Mut3和Mut4),再将其分别与Flag-NEDD8质粒共转入BNL CL.2细胞中,免疫沉淀结合Western蛋白印记法,考察突变体的Neddylation修饰情况,初步确定修饰位点所在功能区。4.在BNL CL.2细胞中共转HA-Ub和Myc-SDHA质粒,再分别转入Flag-NEDD8或pcDNA3.1(-)质粒空载体,通过免疫沉淀结合Western蛋白印记法来考察SDHA的Neddylation修饰对其泛素化的影响;取两组BNLCL.2细胞,对照组加入DMSO,另一组加入NEDD8类泛素化修饰的特异性抑制因子MLN4924,同时各加入抑制蛋白质合成的放线菌酮(CHX)进行时间梯度处理,通过Western蛋白印记法考察两组BNLCL.2细胞中SDHA蛋白半衰期的不同,明确Neddylation修饰对SDHA蛋白稳定性的影响;在BNL CL.2细胞中转入Myc-SDHA质粒,其中一组加入DMSO,另一组用MLN4924处理24 h,进行免疫荧光实验,观察Neddylation修饰对SDHA蛋白亚细胞定位的影响。结果与讨论:SDHA蛋白表达降低,会使BNLCL.2细胞周期发生阻滞从而抑制细胞增殖;外源和内源的SDHA蛋白均能发生Neddylation修饰,修饰位点位于蛋白的第二个结构域;SDHA的Neddylation修饰可以拮抗其泛素化修饰,并具有使蛋白稳定的作用,但并不能改变蛋白的亚细胞定位。综上所述,本论文首次揭示了 SDHA对于维持肝细胞生物学功能的重要性,尝试为肝脏相关疾病的预防和治疗提供新的理论依据;发现了Neddylation修饰的新底物——线粒体蛋白SDHA,并初步确认了其修饰位点所在的结构域,这对于认识Neddylation通路的新功能具有十分重要的意义;本论文首次阐明了SDHA蛋白稳定性调控机制,并探讨了 Neddylation对SDHA的其他调控作用,这提示我们在靶向Neddylation通路治疗相关疾病的同时,应考虑其功能的复杂性。