OLP白念菌丝特异基因HSGs双相表达差异及菌丝培养和RNA提取方法的探讨

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目的:探索口腔扁平苔藓中白念珠菌菌相转换的机制和意义,研究调控菌丝形成的关键因素。包括探讨白念菌丝形成与培养所用血清的不同灭活程度的关系,分析不同菌相白念RNA提取的适宜破壁方法。方法:自100例含41例糜烂型和59例非糜烂型的口腔扁平苔藓病人中分离白念珠菌,将之与标准实验株一同进行RPMI1640加不同程度灭活的小牛血清培养基进行其菌丝相细胞培养,计算菌丝形成率;采用改良热酸酚法及酸洗玻璃珠法对念珠菌菌丝相及酵母相细胞破壁提取总RNA;对RNA定性定量及完整度检测;通过RT-PCR及Real-Time PCR对提取的RNA对4个菌丝特异基因HGC1.ECE1、 HWP1、ALS3及1个信号调控分子EFG1基因在菌丝相及酵母相中的基因表达差异进行检测。结果:(1)念珠菌和白念珠菌的检出情况:59例非糜烂型扁平苔藓中分离得白念珠菌5例,热带念珠菌1例;41例非糜烂型扁平苔藓中分离得白念珠菌6例,克柔念珠菌1例,近平滑念珠菌1例,白色丝孢酵母菌1例,非糜烂型扁平苔藓组与糜烂型OLP组间的念珠菌培养阳性率有显著差异(P<0.05);非糜烂型组与糜烂型OLP组间的白念珠菌培养阳性率亦有显著差异(P<0.05)。(2)菌丝形成时间和培养纯度:白念珠菌在pH=7.0、37℃恒温培养箱、以及RPMI1640+121℃灭活小牛血清中的菌丝形成时间及形成纯度均比在RPMI1640+56℃灭活小牛血清培养基中好。(3)白念珠菌RNA提取情况,菌丝相:①改良热酸酚法提取浓度均值为384.74μg/ml,吸光度比值为2.11-2.21;②酸洗玻璃珠法均值为224.45μg/ml,吸光度比值为1.62-1.87。酵母相:①改良热酸酚法提取浓度均值为578.88μg/ml,260/280吸光度比值2.07-2.2;②酸洗玻璃珠法均值为636.41μg/ml,吸光度比值1.87-2.05。(4)菌丝特异基因表达情况:Real-time PCR显示EFG1、ALS3、ECE1在酵母相及菌丝相表达中无明显差异;HWP1、HGC1仅在菌丝相中表达,酵母相细胞中微量测得。结论:(1)糜烂型OLP患者念珠菌和白念珠菌检出率均高于非糜烂型OLP患者;(2)预采用1640+121℃灭活的小牛血清培养基培养较纯净菌丝相白念珠菌具有较明确的改良优势;(3)菌丝相白念珠菌宜用改良热酸酚法提取RNA,而酵母相细胞宜用酸洗玻璃珠法;(4)本实验表明HWP1、HGC1可能是白念菌丝形成的必需基因,本研究显示ALS3、ECE1、EFG1可能不是菌丝形成的必需基因。
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