【摘 要】
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TRIM25和IFN-β是机体内重要的先天性抗病毒免疫分子,在人和哺乳动物一些疾病预防和治疗过程中已开展应用尝试,有关它们在鸡生产临床中的应用还鲜有报道。本研究主要建立鸡TRIM25和鸡IFN-β体外表达方法,结合体内体外试验分析其表达产物生物活性,为研制新型药物提供科学依据。本研究首先根据鸡IFN-β基因序列设计引物,以鸡肝脏DNA的基因为模板扩增目的基因,构建pET-32a-IFN-β原核表达
【基金项目】
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山东省重大技术集成重点研发项目（2019JZZY010735）； 山东省自然科学基金面上项目（ZR2020MC179）（ZR2019MC044）；
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TRIM25和IFN-β是机体内重要的先天性抗病毒免疫分子,在人和哺乳动物一些疾病预防和治疗过程中已开展应用尝试,有关它们在鸡生产临床中的应用还鲜有报道。本研究主要建立鸡TRIM25和鸡IFN-β体外表达方法,结合体内体外试验分析其表达产物生物活性,为研制新型药物提供科学依据。本研究首先根据鸡IFN-β基因序列设计引物,以鸡肝脏DNA的基因为模板扩增目的基因,构建pET-32a-IFN-β原核表达载体,经1 mmol/L的IPTG在37℃摇床中诱导4h,表达出了包涵体蛋白,并对包涵体蛋白进行破碎纯化,获得了含量较高的目的蛋白。其次,利用实验室已构建的鸡TRIM25原核表达载体和毕赤酵母表达载体分别诱导表达,获得相应表达产物,经纯化和Western blot鉴定分析。第三,使用鸡pET-32a-IFN-β蛋白和pET-32a-TRIM25蛋白分别与鸡NDV弱毒疫苗和ALV-A蛋白抗原联合接种SPF鸡,检测NDV疫苗抗体与ALV-A蛋白抗体滴度和淋巴细胞增殖反应;使用pET-32a-TRIM25和Ppic9k-TRIM25蛋白分别与AIV灭活疫苗和ALV-A蛋白抗原联合接种SPF鸡,检测AIV疫苗与ALV-A蛋白的抗体滴度和淋巴细胞增殖反应,比较它们的免疫增强作用。第四,体外细胞试验分析一定浓度的三种蛋白对ALV-A复制的影响。结果显示:（1）PCR扩增获得鸡IFN-β基因大小为537 bp,构建的pET-32a-IFN-β重组表达质粒能够诱导表达大小为37 k Da的目的蛋白条带,经镍柱层析纯化后蛋白含量达到95%以上。（2）利用实验室构建的鸡TRIM25原核表达质粒和毕赤酵母表达质粒经诱导后获得大小为75 k Da的目的蛋白,前者为包涵体蛋白pET-32a-TRIM25,后者为分泌型蛋白Ppic9k-TRIM25。（3）pET-32a-TRIM25蛋白和pET-32a-IFN-β蛋白能够显著提高NDV弱毒疫苗与ALV-A蛋白抗原的抗体免疫反应和淋巴细胞增殖反应,但pET-32a-TRIM25蛋白增强效果更为显著。（4）pET-32a-TRIM25和Ppic9k-TRIM25蛋白均能显著提高鸡AIV灭活疫苗与ALV-A蛋白抗原的抗体免疫反应和淋巴细胞增殖反应,且Ppic9k-TRIM25蛋白免疫增强效果显著高于pET-32a-TRIM25蛋白。（5）2μg的pET-32a-IFN-β蛋白在不同时间下均能够显著抑制ALV-A病毒在DF-1细胞的复制,而pET-32a-TRIM25和Ppic9k-TRIM25蛋白抑制ALV-A病毒复制的效果不明显。结论:本研究成功建立了获得鸡IFN-β和鸡TRIM25生物活性蛋白的方法,体外表达的蛋白产物均不同程度提高疫苗的血清抗体反应和淋巴细胞增殖反应,且鸡IFN-β还能显著抑制ALV-A复制,这为两种蛋白的开发应用提供方法依据和理论依据。
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