本课题以类叶牡丹为例,采用液相色谱-电喷雾-四级杆飞行时间质谱(LC-ESI-QTOF)、超高效液相色谱-傅里叶转化高分辨质谱(UHPLC-Exactive FT-HR-MS)和直接注射电喷雾离子阱串联质谱(DI-ESI-IT-MSn)等质谱技术,研究类叶牡丹三萜皂苷类化合物,旨在进行更深入的药效物质基础研究,发现和预测类叶牡丹中微量的三萜皂苷,共确定或暂时鉴定了 80个三萜皂苷类化合物,其中32个三萜皂苷首次从红毛七属中发现,46个为潜在的新三萜皂苷类化合物,并包含23个新颖的独特的丙二酰基-三萜皂苷。在确(鉴)定的三萜皂苷类化合物中,首次发现并鉴定了两个新颖的具有线性结构的六糖α-糖链(C-28糖链),即Glc6←Glc4←Rha4←Glc6←Glc4←Rha 和 Glc6←Glc4←Rha4←Glc6←Glc4←Glc;首次发现并鉴定了新颖的具有分支结构的五糖和四糖β-糖链(C-3糖链),即Rha→Glc→Glc(Glc)→2,3Ara 和 Glc→Glc(Glc)→2,3Ara;并首次在类叶牡丹中发现11-羰基-葳严仙、11-羰基-常春藤和11-羰基-齐墩果酸三个新的皂苷元。同时,总结的ESI-QTOF、Exactive FT-MS和DI-ESI-IT-MSn质谱分析方法,为其它植物中三萜皂苷类化合物的质谱研究提供了范例,为研制、开发出有效、安全和可控的抗风湿新药提供科学的依据。论文研究成果简要总结如下:1.对葳严仙属三萜皂苷进行了系统的综述研究从提取、分离和结构鉴定等几个方面对葳严仙属三萜皂苷进行了系统的综述研究,总结了葳严仙属三萜皂苷糖链的变化、苷元的可能生物合成途径,为类叶牡丹三萜皂苷的质谱研究提供了夯实的文献基础。2.建立了类叶牡丹三萜皂苷LC-ESI-QTOF质谱定性分析方法本论文通过液相色谱-四级飞行时间质谱,在阳离子模式下对类叶牡丹三萜皂苷进行了深入系统的研究,取得了多个研究成果。2.1.根据特征性离子,确定了红毛七属皂苷元的研究方案:在正离子模式下,若发现m/z 489.3、471.3、453.3和435.3等特征离子,皂苷元可鉴定为葳严仙;若发现m/z 473.3、455.3和437.3等特征离子,皂苷元可鉴定为常春藤皂和刺囊酸,而且常春藤皂和刺囊酸皂苷元可通过特征离子m/z 437.3和455的强度比率来辨别,若比值大于1.2,该皂苷元可鉴定为常春藤皂苷元,如比值小于0.8,该皂苷元可鉴定为刺囊酸皂苷元;若发现m/z 457.3和439.3等特征离子,皂苷元可鉴定为齐墩果酸;若发现m/z 503.3和485.3等特征离子,皂苷元可鉴定为11-羰基-葳严仙;若发现m/z 487.3和469.3等特征离子,皂苷元可鉴定为11-羰基-常春藤;若发现m/z 471.3和453.3等特征离子,皂苷元可鉴定为11-羰基-齐墩果酸,并通过二级质谱分析了后三种新的葳严仙皂苷裂解规律,进一步印证了这些皂苷元的正确性。2.2.确定了 C-28位寡糖序列研究方法:通过特征性的跨环裂解反应离子,毫无疑问的鉴定了葳严仙皂苷的C-28位寡糖离子m/z 493.2和963.5,其分别为线性的 Glc6←Glc4←Rha 和 Glc6←Glc4←Rha4←Glc6←Glc4←Rha。以六糖寡糖G1c6←Glc4←Rha4←Glc6←Glc4←Rha为例,在负离子模式下,跨环裂解离子以2,4X和 0,4X 类型为主,包括 m/z 837.2875(0,4X6α),675.2343(0,4X5α),529.1712(2,4X4α),367.1281(0,4X3α)和247.0835(0,4X2α);在正离子模式下,跨环裂解离子以RDA产物离子3,5X 类型为主,包括m/z 8 75.5(3,5X6α),713.4(3,5X5α)和 551.4(3,5X4α)。出现3,5X4α在m/z 551.4证明两个3糖分子是以4←1方式相连接的,而非3←1和2←1。同时在m/z 509、535、965、979处发现新颖的C-28寡糖离子,并通过二级质谱对其进行了糖链序列结构的解析。2.3.确定了 C-3位寡糖序列研究方法:通过[Y0α+Na]+和[Aglycone+Na]+的差值,对C-3位葳严仙寡糖进行分析,若差值为132 Da,162 Da,264 Da,278 Da,294 Da,424 Da 和 456 Da,确定 C-3 糖链分别为 Ara,Glc,Ara-Ara,Rha-Ara,Glc-Ara,Rha-Rha-Ara 和 Glc-(Glc)-Ara;若差值为 174Da,190 Da,322 Da 和 336 Da,确定 C-3 糖链分别为 acetyl-pentose,GlcUAOCH3,Ara-Acetylpentose 和Glc-Acetylpentose。其中发现了乙酰化五碳糖(acetyl-pentose),亦为红毛七属皂苷糖链的重要组成部分,迄今在红毛七属并无发现具有乙酰化五碳糖的葳严仙皂苷。此外,C-3位寡糖亦通过分析[Y0α+Na]+离子的多级质谱,对其验证。2.4.构建了红毛七属皂苷的部分质谱研究策略:按此策略从红毛七属黑龙江产类叶牡丹中确(鉴)定了 51个三萜皂苷,32个三萜皂苷首次从红毛七属发现,18个潜在的新三萜皂苷,并通过传统的植物化学研究,证明了 9个潜在的新化合物。此研究成果,扩宽了研究者对红毛七属化学成分的理解,亦为今后植物化学研究指明了方向。3.建立了类叶牡丹三萜皂苷UHPLC-Exactive FT-MS质谱定性分析方法3.1在阳离子模式下,分析9个类叶牡丹皂苷标准品,总结以下四点规律:在CID值为0V时,所有的化合物表现为高强度的[M+H]+或[M+NH4]+离子,伴随着较小的或没有[M+Na]+离子;在CID值为25V时,[M+H]+或[M+NH4]+离子部分解离,形成较强的[M+Na]+、[Agly.+H-H2O]+、[Agly.+H-2H2O]+以及丰富的[M+H]+碎片离子,通过这些碎片离子,能够有助于我们判断苷元的信息,糖与糖之间的连接信息;当CID值继续增加为50 V时,[M+H]+离子被过度碎裂,逐渐[M+Na]+离子表现为基峰;当CID值为100 V时,所有的双糖链皂苷均裂解生成[B3α+Na]+和[Y0α+Na]+,并且[Y0α+Na]+离子会进一步裂解失去C-3糖链上的糖基,生成[Y0β+Na]+等碎片离子。而且,由于提供的准确分子量,有助于进一步推测各个碎片离子的结构。3.2在负离子模式下,分析9个类叶牡丹皂苷标准品,总结以下四点规律:当CID值为0V时,所有的化合物表现为高强度的[M-H]-离子,伴随着较小的或没有[M+HCOOH-H]+离子;当CID值逐渐增加,对于双糖链皂苷,C-28位酯苷键优先断裂,[M-H]-离子生成强度较弱的[Bα-H]-和强度较高的[Y0α-H]-碎片离子,随后从β-糖链的外端糖至内段糖开始相继断裂,得到失去各个糖基的碎片离子,同时能够观察到强度较弱的[Agly.-H]-离子;对于单糖链皂苷,即使其具有游离的C-28位羧基,也不发生中性损失CO2分子,产生[M-CO2-H]-离子;对于β-糖链中Glc→3Ara 和 Glc→2Ara,可以通过 CID 值为100时,[Y0α-Glc-H]-和[Y0α-H]-的离子强度比值来确定,前者离户强度比值明显大于1,而后者明显小于1。3.3基于UHPLC-Exactive FT-MSn质谱分析方法的实际样品分析通过Exactive FT-MS在正负离子模式下的裂解途径,建立了丙二酰基-三萜皂苷的Exactive FT-MS研究方法,对类叶牡丹中微量的丙二酰基-三萜皂苷类成分进行了深入的研究,发现并暂时鉴定了 23个新的丙二酰基-三萜皂苷,这些丙二酰基-三萜皂苷在小檗科植物中亦为首次发现。此研究成果,更加扩宽了研究者对红毛七属化学成分的理解,为中药有机化学增加了新的研究内容,亦为今后植物化学研究指明了方向。4.建立了类叶牡丹三萜皂苷DI-ESI-IT-MSn质谱定性分析方法4.1分析类叶牡丹三萜皂苷标准品[M+Na]+离子①区分单糖链和双糖链皂苷:对于双糖链皂苷,二级质谱(MS/MS)分析[M+Na]+离子,均只产生[Y0α+Na]+和[Bα+Na]+离子。可能的原因为C-28位酯苷键较C-3位醚键稳定性差,一个微弱的碰撞能就能致使其断裂生成[Y0α+Na]+和[Bα+Na]+。三级质谱(MS3)分析进一步分析[Y0α+Na]+离子,C-28位羧基优先断裂,失去CO2,生成[Y0α-CO2+Na]+离子。四级质谱(MS4)分析[Y0α-CO2+Na]+离子。对于单糖链(仅有C-3糖链)皂苷,二级质谱(MS/MS)分析[M+Na]+离子,首先失去中性CO2,生成[M-CO2+Na]+离子;三级质谱(MS3)分析[M-CO2+Na]+,能够观察到其序列失去糖基的离子。②糖链长短对离子强度的影响:对于双糖链皂苷,在二级质谱(MS/MS)中,我们观察到[Y0α+Na]+和[Bα+Na]+的离子强度,与其自身所含有的糖链长短有密切的关系。当β-糖链由Ara被Glc→Ara所取代,α-糖链保持不变(Rha→4Glc→6Glc),则离子强度比值([Y0α+Na]+/[Bα+Na]+)显著增强,具有统计学意义。一种可能的解释为当执行二级质谱(MS/MS)时,对[M+Na]+离子施加碰撞能,酯苷键优先断裂,产生的[Y0α+Na]+和[Bα+Na]+离子,为一对互补的竞争性阳离子,其自身所含有的糖链长度决定其捕获钠离子的能力。如果一个皂苷α-糖链含有的糖基个数明显多于β-糖链糖基个数,Bα将更容易捕获钠离子,产生高的离子强度。否则,由于β-糖链含有的糖基个数明显多于α-糖链糖基个数,Y0α将更容易捕获钠离子,产生高的离子强度。③区分Glc→3Ara和Glc→2Ara糖基:皂苷标准品1、4、5、7和8含有的β-糖链为Glc→2Ara,而皂苷标准品3含有的β-糖链为Glc→3Ara,通过执行串联质谱分析,在四级质谱(MS4)中的[C2β+Na]+和[B2β+Na]+的离子强度进行Glc→2Ara和Glc→3Ara区分。如果[C2β+Na]+和[B2β+Na]+的离子强度比值大于等于1.3,那么β-糖链为Glc→2Ara;如果[C2β+Na]+和[B2β+Na]+的离子强度比值小于等于0.5,那么β-糖链为Glc→3Ara。4.2基于DI-ESI-IT-MSn质谱分析方法的实际样品分析通过IT-MSn分析标准品,在正离子模式总结的裂解规律,对类叶牡丹中几个微量的三萜皂苷[M+Na]+离子m/z 1729.5、m/z 1745.6和m/z 1583.7进行了研究,它们均产生非互补的[Y0α+Na]+和[Bα+Na]+离子。首次发现并鉴定了新颖的具有分支结构的五糖和四糖β-糖链,即Rha→Glc→Glc(Glc)→2,3Ara和Glc→Glc(Glc)→2,3Ara。5.建立了类叶牡丹三萜皂苷UHPLC-Exactive FT-MS定量分析方法为了准确反映药物的质量和疗效的关系,本文改变了以往用单一指标成分为标准进行质量评价的方法,同时采用9种三萜皂苷作为指标性成分,通过窄质量窗口(20mD)建立了类叶牡丹的UHPLC-Exactive FT-MS含量测定方法。通过方法学考察,证实了建立的定量分析方法具有简便、快速、重现性好,已成功应用于3批类叶牡丹毛发根中9个皂苷类化合物的同时定量研究。