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转移是引起恶性肿瘤死亡的主要生物学特性和原因。肿瘤转移的步骤包含相应的顺序以及相关联的步骤过程,其中很多步骤受到上皮间质转化(EMT)的影响。肿瘤细胞获得间充质特性的能力,可以增强细胞的迁移和侵袭能力、诱发肿瘤细胞的干细胞特性,并抑制细胞凋亡和程序性衰老,使肿瘤细胞发生转移。上皮间质转化(EMT)的过程已经被报道在多种恶性肿瘤中发挥作用包括结肠癌(CRC)。结肠癌(CRC)是发生在结肠部位的消化道肿瘤,为我国最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率不断增高,严重危害了人们的身体健康。在美国,因癌症死亡的恶心肿瘤中结肠癌(CRC)位居第三位,据报告每年大约造成50000人左右死亡。虽然手术结合辅助治疗提高了结肠癌(CRC)的预后生存率,但是仍有大约一半的患者发生了转移。抑制结肠癌(CRC)的转移是改善结肠癌(CRC)的发生发展及其预后的有效治疗策略。微小RNA(miRNAs)是一类通过与靶基因的3′非编码区(UTR)相结合,从而在转录水平调控靶基因蛋白表达水平的非编码单链小核糖核酸(RNA)分子。一些研究表明miRNAs可以作为调控上皮间质转化(EMT)的重要抑制剂或启动子。SMAD蛋白家庭成员3(Smad3)作为TGF-β信号通路的下游的一个关键因素,同时也是恶性肿瘤如结肠癌(CRC)发生上皮间质转化(EMT)的一个至关重要的诱导物。TGF-β结合两个跨膜受体,I型(TGFBRI)和II型(TGFBRII),导致Smad2(p-s Smad2)和Smad3(p-Smad3)磷酸化,同时活化物在细胞核内与Smad4相结合,结合物可以调节下游上皮间质转化(EMT)相关基因的表达。有研究确认,Smad3是micro RNA-140-5p(miR-140)的直接靶点。miR-140首次明确发现是于斑马鱼和小鼠胚胎的软骨发育包括长和扁骨发生发展中,miR-140可以抑制结肠癌干细胞(CSC)的生存和转移可能通过抑制Smad2和自噬来完成的。下调miR-140诱导上皮间质转化(EMT)的发生,促进肿瘤细胞侵袭和转移可能是通过调控靶基因Slug来完成的。miR-140在影响结肠癌(CRC)侵袭和转移的机制有待进一步研究。第一部分miR-140靶向调控Smad3基因的表达研究目的:验证Smad3确为miR-140的靶点。方法:在结肠癌细胞系HCT116和RKO中通过瞬时转染,使miR-140上调或者下调,并且同时转染沉默Smad3的模拟物(si RNA),通过q RT-PCR测量转染后,miR-140的表达高低变化,以及Smad3 m RNA。应用免疫印迹的方法检测Smad3和p-Smad3蛋白变化,来验证转染率,以及小RNA miR-140与基因Smad3之间的关系。CCK8实验检测miR140对细胞增殖的影响。通过平板克隆形成实验来检测miR-140对结肠癌细胞HCT116和RKO细胞克隆形成能力的影响;结果:通过荧光q RT-PCR检测,转染miR-140的结肠癌细胞HCT116和RKO中与对照组相比,miR140组中的miR-140表达增高,具有统计学意义(P<0.01);与对照组相比,上调miR-140后Smad3 m RNA含量无增减变化,差异无统计学意义(P>0.05)。免疫印迹结果显示,与对照组相比miR-140组Smad3和p-Smad3的蛋白含量降低,且具有统计学意义(P<0.01),并且抑制了肿瘤细胞的生长和细胞克隆形成的能力(P<0.01)。而在结肠癌细胞HCT116和RKO中转染,使miR-140低表达能使细胞中Smad3和p-Smad3蛋白表达增高(P<0.01),并且促进了肿瘤细胞的生长和细胞的克隆形成能力;而miR-140抑制剂和Smad3 si RNA共转染对Smad3和p-Smad3蛋白表达和肿瘤生长、细胞的克隆形成能力无明显影响(P>0.05)结论:上调miR-140可使Smad3和p-Smad3表达降低,但不影响Smad3 m RNA的表达,并且抑制了肿瘤细胞的生长:相反使miR-140的表达降低,可升高Smad3和p-Smad3的含量,并且促进肿瘤生长。miR-140能够靶向调控基因Smad3的表达来影响肿瘤生长、细胞的克隆形成能力。第二部分miR-140调控EMT的作用机制研究目的:通过体外实验探讨miR-140调控EMT对结肠癌细胞HCT116和RKO迁移和侵袭能力的影响。方法:在结肠癌细胞系HCT116和RKO中通过瞬时转染,使miR-140上调或者下调,并且同时转染沉默Smad3的模拟物(si RNA),通过划痕实验和Transwell迁移和侵袭实验,研究高表达或低表达miR-140对结肠癌细胞系HCT116和RKO迁移和侵袭能力的作用方式。免疫印迹和免疫荧光细胞化学法研究EMT相关蛋白E-cadherin及Vimentin的含量变化。探讨miR-140在结肠癌细胞迁移侵袭中的作用及其调控机制。结果:划痕实验结果显示,与对照组相比miR-140组细胞的迁移能力减弱,细胞的迁移距离具有统计学意义(P<0.01);Transwell迁移和侵袭实验的结果显示,与Con和NC等对照组相比,miR-140组的穿膜细胞数明显减少,且差异具有统计学意义(P<0.01)。EMT相关分子E-cadherin表达增高,而Vimentin表达减少(P<0.01)。si Smad3组与miR-140组的作用相比,其差异无统计学意义(P>0.05);与Con和NC等对照组相比使miR-140表达降低,促进细胞的迁移和侵袭能力,差异具有统计学意义(P<0.01),EMT相关分子E-cadherin表达减少,而Vimentin表达增高(P<0.01)。而miR-140抑制剂和Smad3 si RNA共转染时细胞的迁移和侵袭能力无明显变化(P>0.05)。结论:miR-140的过表达抑制结肠癌细胞HCT116和RKO的迁移和侵袭能力,阻滞了EMT的发生;miR-140的表达降低则促进EMT的发生,增高结肠癌细胞HCT116和RKO的迁移和侵袭能力。同时使miR-140表达降低和沉默Smad3,则对结肠癌细胞HCT116和RKO迁移和侵袭的能力和EMT的发生无明显影响。第三部分miR-140对结肠癌HCT-116细胞裸鼠移植瘤生长和转移的抑制作用目的:探讨过表达miR-140抑制裸鼠移植瘤的机制方法:将裸鼠通过背部或尾静脉注射的方法,各组分别注射慢病毒感染的miR-140细胞、阴性对照细胞、和沉默Smad3的细胞,并采用免疫组织化学染色和western blotting技术分析相关蛋白的表达情况。结果:过表达miR-140组或下调Smad3组移植瘤体积较小,生长缓慢并且转移率较低。肿瘤组织中Smad3,p-Smad3,Vimentin和Zeb1表达减低,E-cadherin表达增高。结论:过表达miR-140能明显抑制裸鼠移植瘤的生长,并可能通过抑制Smad3蛋白的表达来完成的。