论文部分内容阅读
背景：Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)患病率逐年上升，且患者呈年轻化趋势，已成为严重的全球性健康问题。已有研究表明，T2DM患者肠道菌群发生特异性改变，有关肠道菌群与T2DM的发生、发展、治疗及预后的相关性研究日益受到重视。
目的：本研究拟通过检测健康人群及二甲双胍治疗T2DM前后相关肠道菌群的变化，观察T2DM治疗前后特异性肠道菌群改变，为探索肠道菌群参与T2DM发生、发展和治疗机制提供研究方向。
方法：纳入成都中医药大学附属医院内分泌科就诊的30例初诊T2DM患者为初诊组；初诊组患者经二甲双胍治疗一个月后，纳入治疗组；随机纳入同期30例健康体检者作为对照组，收集三组人群一般资料。采集对照组、初诊组及治疗组三组人群的血清和全血，测定肾功能、血脂和糖尿病相关指标进行方差分析；采集三组粪便标本，提取粪便DNA进行16SrDNA分析。通过单分子实时(Single molecule real-time，SMRT)测序，筛选环形一致性序列(Circular Consensus Sequencing，CCS)，进行操作分类单元(Operational Taxonomic Unit， OTU)聚类，得到肠道菌群物种构成及丰度变化；同时对对照组、初诊组及治疗组的肠道菌群菌属丰度与三组一般资料及血液学指标进行相关性分析；基于上述肠道菌群分析结果，通过京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和原核生物同源蛋白簇数据库(Clusters of Orthologous Groups of proteins，COG)探索对照组、初诊组及治疗组的肠道菌群物种组成差异，预测功能蛋白及相关信号通路。
结果：1.对照组、初诊组及治疗组一般资料和血液学指标分析：初诊组和对照组相比除身高外，年龄、体重和BMI差异均具有统计学意义。初诊组与对照组的空腹胰岛素差异具有统计学意义(P＜0.05)；与对照组相比，初诊组和治疗组的甘油三酯、高密度脂蛋白的差异均有统计学意义(P＜0.05)，但治疗前后甘油三酯、高密度脂蛋白的差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.对照组、初诊组及治疗组的肠道菌群物种构成及相对丰度分析：本研究肠道菌群门构成比为：厚壁菌门(Firmicutes)54%，拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿菌门(Chlorobi)21%，变形菌门(Proteobacteria)18%，蓝藻门(Cyanobacteria)4%，未明确归属的细菌3%。进一步检测细菌丰度变化，其中与对照组相比，埃希氏菌属(Escherichia)在治疗组中增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与初诊组相比，巨单细胞菌属(Megamonas)在治疗组中增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。进一步对三组肠道菌群进行种水平分析：拟杆菌属(Bacteroides)的coagulans菌种和优杆菌属(Eubacterium)的coprostanoligenes菌种在初诊组中特异性增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；巨单细胞菌属(Megamonas)funiformis菌种和链球菌属(Streptococcus)salivarius菌种在治疗组中特异性增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
3.肠道菌群与一般资料和血液学指标的相关性分析：埃希氏菌属(Escherichia)和巨单细胞菌属(Megamonas)相对丰度与身高、体重、年龄、BMI、甘油三酯、肌酐正相关，埃希氏菌属(Escherichia)与LDL正相关，与HDL和总胆固醇负相关；巨单细胞菌属(Megamonas)与总胆固醇、HDL和LDL负相关(P＜0.05)。
4.肠道菌群参与T2DM机制预测：通过KEGG和COG等生信分析数据库预测肠道菌群调节T2DM的分子机制。在三组中细胞骨架蛋白富集差异具有统计学意义(P＜0.05)；脂肪细胞因子信号通路、脂肪酸生物合成通路等在初诊组和对照组中富集差异具有统计学意义(P<0.05)；脂肪细胞因子信号在治疗组和对照组中富集差异具有显著的统计学意义(P＜0.001)。通过对蛋白功能和信号通路的生信分析和文献检索预测细胞骨架蛋白和脂肪细胞因子信号通路通过PI3K/AKT信号通路发挥调节作用。
结论：1.T2DM患者易并存甘油三酯和高密度脂蛋白等血脂指标异常。经二甲双胍治疗后空腹血糖和糖化血红蛋白结果明显改善，但空腹胰岛素降低不明显。
2.通过对对照组、初诊组和治疗组相对丰度排名前十的菌属中进行差异性分析筛选出埃希氏菌属(Escherichia)和巨单细胞菌属(Megamonas)相对丰度差异显著，进一步对三组样本中菌种分别进行差异性分析，得到拟杆菌属(Bacteroides)的coagulans菌种和优杆菌属(Eubacterium)的coprostanoligenes菌种在初诊组肠道菌群中特异性增高；巨单细胞菌属(Megamonas)funiformis菌种和链球菌属(Streptococcus)salivarius菌种在治疗组肠道菌群中特异性增高。
3.埃希氏菌属(Escherichia)和巨单细胞菌属(Megamonas)相对丰度与身高、体重、年龄、BMI、甘油三酯、肌酐正相关，埃希氏菌属(Escherichia)与与LDL正相关，HDL和总胆固醇负相关，巨单细胞菌属(Megamonas)与总胆固醇、HDL和LDL负相关。
4.通过对对照组、初诊组和治疗组三组肠道菌群测序结果与KEGG和COG等生信分析数据库进行比对分析发现细胞骨架蛋白在T2DM的发生、发展和治疗中发挥功能蛋白作用；脂肪细胞因子信号通路在T2DM的发生、发展和治疗中发挥代谢通路作用。
目的：本研究拟通过检测健康人群及二甲双胍治疗T2DM前后相关肠道菌群的变化，观察T2DM治疗前后特异性肠道菌群改变，为探索肠道菌群参与T2DM发生、发展和治疗机制提供研究方向。
方法：纳入成都中医药大学附属医院内分泌科就诊的30例初诊T2DM患者为初诊组；初诊组患者经二甲双胍治疗一个月后，纳入治疗组；随机纳入同期30例健康体检者作为对照组，收集三组人群一般资料。采集对照组、初诊组及治疗组三组人群的血清和全血，测定肾功能、血脂和糖尿病相关指标进行方差分析；采集三组粪便标本，提取粪便DNA进行16SrDNA分析。通过单分子实时(Single molecule real-time，SMRT)测序，筛选环形一致性序列(Circular Consensus Sequencing，CCS)，进行操作分类单元(Operational Taxonomic Unit， OTU)聚类，得到肠道菌群物种构成及丰度变化；同时对对照组、初诊组及治疗组的肠道菌群菌属丰度与三组一般资料及血液学指标进行相关性分析；基于上述肠道菌群分析结果，通过京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和原核生物同源蛋白簇数据库(Clusters of Orthologous Groups of proteins，COG)探索对照组、初诊组及治疗组的肠道菌群物种组成差异，预测功能蛋白及相关信号通路。
结果：1.对照组、初诊组及治疗组一般资料和血液学指标分析：初诊组和对照组相比除身高外，年龄、体重和BMI差异均具有统计学意义。初诊组与对照组的空腹胰岛素差异具有统计学意义(P＜0.05)；与对照组相比，初诊组和治疗组的甘油三酯、高密度脂蛋白的差异均有统计学意义(P＜0.05)，但治疗前后甘油三酯、高密度脂蛋白的差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.对照组、初诊组及治疗组的肠道菌群物种构成及相对丰度分析：本研究肠道菌群门构成比为：厚壁菌门(Firmicutes)54%，拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿菌门(Chlorobi)21%，变形菌门(Proteobacteria)18%，蓝藻门(Cyanobacteria)4%，未明确归属的细菌3%。进一步检测细菌丰度变化，其中与对照组相比，埃希氏菌属(Escherichia)在治疗组中增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与初诊组相比，巨单细胞菌属(Megamonas)在治疗组中增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。进一步对三组肠道菌群进行种水平分析：拟杆菌属(Bacteroides)的coagulans菌种和优杆菌属(Eubacterium)的coprostanoligenes菌种在初诊组中特异性增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；巨单细胞菌属(Megamonas)funiformis菌种和链球菌属(Streptococcus)salivarius菌种在治疗组中特异性增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
3.肠道菌群与一般资料和血液学指标的相关性分析：埃希氏菌属(Escherichia)和巨单细胞菌属(Megamonas)相对丰度与身高、体重、年龄、BMI、甘油三酯、肌酐正相关，埃希氏菌属(Escherichia)与LDL正相关，与HDL和总胆固醇负相关；巨单细胞菌属(Megamonas)与总胆固醇、HDL和LDL负相关(P＜0.05)。
4.肠道菌群参与T2DM机制预测：通过KEGG和COG等生信分析数据库预测肠道菌群调节T2DM的分子机制。在三组中细胞骨架蛋白富集差异具有统计学意义(P＜0.05)；脂肪细胞因子信号通路、脂肪酸生物合成通路等在初诊组和对照组中富集差异具有统计学意义(P<0.05)；脂肪细胞因子信号在治疗组和对照组中富集差异具有显著的统计学意义(P＜0.001)。通过对蛋白功能和信号通路的生信分析和文献检索预测细胞骨架蛋白和脂肪细胞因子信号通路通过PI3K/AKT信号通路发挥调节作用。
结论：1.T2DM患者易并存甘油三酯和高密度脂蛋白等血脂指标异常。经二甲双胍治疗后空腹血糖和糖化血红蛋白结果明显改善，但空腹胰岛素降低不明显。
2.通过对对照组、初诊组和治疗组相对丰度排名前十的菌属中进行差异性分析筛选出埃希氏菌属(Escherichia)和巨单细胞菌属(Megamonas)相对丰度差异显著，进一步对三组样本中菌种分别进行差异性分析，得到拟杆菌属(Bacteroides)的coagulans菌种和优杆菌属(Eubacterium)的coprostanoligenes菌种在初诊组肠道菌群中特异性增高；巨单细胞菌属(Megamonas)funiformis菌种和链球菌属(Streptococcus)salivarius菌种在治疗组肠道菌群中特异性增高。
3.埃希氏菌属(Escherichia)和巨单细胞菌属(Megamonas)相对丰度与身高、体重、年龄、BMI、甘油三酯、肌酐正相关，埃希氏菌属(Escherichia)与与LDL正相关，HDL和总胆固醇负相关，巨单细胞菌属(Megamonas)与总胆固醇、HDL和LDL负相关。
4.通过对对照组、初诊组和治疗组三组肠道菌群测序结果与KEGG和COG等生信分析数据库进行比对分析发现细胞骨架蛋白在T2DM的发生、发展和治疗中发挥功能蛋白作用；脂肪细胞因子信号通路在T2DM的发生、发展和治疗中发挥代谢通路作用。