近年来,CRISPR已成为对抗外源逆转录病毒病原体和器官移植中灭活内源性逆转录病毒的重要且有前途的工具。CRISPR-Cas系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated systems)是细菌及古生菌产生和进化的抵御外来遗传物质入侵的适应性免疫系统,通过形成cr RNA(CRISPR RNA)-效应蛋白复合物,识别并破坏特定的外源序列,比如噬菌体病毒和外源DNA,某些情况下为RNA。基于该系统的特性,现已开发出一系列高效的基因编辑工具,被广泛应用于对各宿主基因组进行编辑。CRISPR-Cas12a蛋白,属于CRISPR核酸内切酶家族的2类V型蛋白,缺乏HNH结构域,具有单个Ruv C核酸酶结构域和一个推定的Nuc结构域,分别负责两条DNA链的切割。Cas12a蛋白同时具有DNA和RNA核酸酶活性,可实现对多个基因的同时编辑,常在细菌、植物和哺乳动物细胞中调节异源DNA编辑。2类VI型CRISPR-Cas13效应蛋白,具有特异地靶向和切割单链RNA而不是双链DNA底物的独特能力。Cas13a蛋白含有两个高等真核生物和原核生物核苷酸结合(HEPN)结构域,其二元效应复合物在cr RNA引导下,作用于与原间隔序列互补的单链RNA。Cas13a-cr RNA复合物与靶标RNA结合后被激活,随后可在宿主细胞中切割非特异性的其它单链RNA,抑制宿主细胞的生长速率。目前一项研究发现,激活的Cas13a通过诱导被感染细胞的细胞生长停滞,为细菌宿主提供了一种“被动保护”机制,以此防御DNA噬菌体的侵染。这表明Cas13a除具有靶向和裂解RNA病毒的能力外,还可以使细菌细胞抵御DNA入侵者。总的来说,Cas12a和Cas13a效应子提供了一些独特的分子特征和CRISPR作用的新机制,使其实现了跨“中心法则”的基因操作,但目前尚未有利用二者干扰逆转录病毒进行的评估。逆转录转座子是由RNA介导转座的转座子元件,通过转录合成m RNA,再反转录合成新的DNA元件整合到基因组中以完成转座。Tf1是一种来自裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的逆转录转座子,编码一个长的多聚蛋白,其侧翼为385个碱基的长末端重复序列(LTRs)。LTR逆转录转座子和逆转录病毒在基因组结构、复制机制和生命周期等方面有许多共同的特征,二者都通过逆转录进行复制,并通过整合到宿主基因组中进行繁殖,在真核细胞中完成复制和跳跃。因此,LTR逆转录转座子可以作为研究逆转录病毒的一个有效模型。本研究首先在裂殖酵母菌株内开发了CRISPR-Cas12a基因编辑工具,构建了靶向酵母内源基因的基因编辑系统,并测试了不同亚种Cas12a蛋白的编辑效率;比较筛选出在裂殖酵母细胞内编辑效率较高Cas12a蛋白--新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)来源的Fn Cas12a效应蛋白进行后续实验。然后通过将裂殖酵母中LTR逆转录转座子Tf1改造为模型系统,利用CRISPR-Cas12a和CRISPR-Cas13a蛋白分别干扰逆转座子Tf1的转座活动,并对两种不同的干扰机制进行了评估。研究表明Fn Cas12a蛋白对Tf1转座过程的DNA阶段进行靶向干扰,表现出强烈的抑制作用,但仍残留少许转座活性;我们猜测这些残留的转座活性可能是Tf1复制过程中RNA/c DNA中间产物在病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)中受到保护而持续存在的结果。因此,我们进一步构建了能使cr RNA长期存在的新菌株体,再次利用Fn Cas12a干扰逆转座,结果完全消除Tf1残留的转座活性。另一方面,我们发现将CRISPR-Cas13a靶向Tf1 RNA中间体也可以显著抑制Tf1的转座。但与细菌宿主不同,Tf1转录本对Cas13a的持续激活不会导致裂殖酵母细胞生长停滞,这表明病毒激活的Cas13a在真核细胞中触发的作用可能不同。综上,本研究深入了解了新型CRISPR机制在对抗逆转录病毒病原体中的作用,并为开发治疗逆转录病毒相关疾病的新策略建立了系统参数。