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人腺病毒（Human Adenovirus,HAdV）感染可引起多种临床综合征,包括呼吸道疾病、结膜炎、膀胱炎、肠胃炎、神经系统疾病等。目前已发现和报道的腺病毒血清型有90余种,其主要感染人群有婴幼儿、免疫力低下病人以及训练营新兵等。然而目前针对腺病毒感染并没有有效的治疗药物,美国国防部和以色列梯瓦制药工业有限公司联合研制的4型和7型口服新病毒活疫苗在军队新兵预防腺病毒疫情爆发方面显示了显著的效果,然而我国并没有相关的疫苗上市或者用于军人免疫的特需疫苗。近年来我国地方和军队都有较大规模的腺病毒疫情爆发,其中以HAdV-7引起的感染最为常见,造成的危害也最为严重,因此发展HAdV-7疫苗具有重要意义。中和抗体作为HAdV-7流行病学研究的重要研究对象,也是HAdV-7疫苗免疫效果评价的关键指标。传统HAdV-7中和抗体的检测方法是基于细胞病变法（CPE）,该方法具有周期性长（48天）,灵敏度低,稳定性差等不足之处[1]。本研究中建立了利用报告基因法定量检测HAdV-7中和抗体的新方法。我们利用同源重组构建了E1区和E3区部分缺失,并在E1区缺失部位嵌入带有荧光素酶表达框的pAd7-Luc重组质粒,转染HEK293细胞,从而包装出能够表达荧光素酶报告基因的Ad7重组病毒（Ad7-Luc）。基于Ad7-Luc重组病毒建立了报告基因检测HAdV-7中和抗体的方法,并进行了方法学验证。结果显示:构建的Ad7-Luc重组病毒,病毒滴度可达4.85×108 IFU/mL。报告基因检测法与传统细胞病变效应（CPE）法检测HAdV-7中和抗体具有良好的一致性（R=0.8612,P<0.0001）,批内和批间差异分别在10%和20%以内。与传统的细胞病变方法相比,HAdV-7中和抗体报告基因检测方法更加快速（1天）、灵敏、准确,适用于HAdV-7血清流行病学调查以及相关疫苗的中和抗体检测。利用该方法我们共检测了北京和泰州两地375份健康成人血清样本,结果显示:北京和泰州两地HAdV-7血清阳性率分别为56.47%（144/255）和57.50%（69/120）,其中低滴度水平（12200）阳性血清数分别占总阳性血清样本的70.14%（101/144）和85.51%（59/69）。与实验室前期HAdV-4和HAdV-5检测数据进行统计分析发现两地HAdV-7血清阳性率显著低于HAdV-5（p<0.001）,而与HAdV-4无显著性差异（p>0.05）;同时发现HAdV-7血清阳性率并不存在性别间差异,并随着年龄的增长呈现逐渐上升的趋势。接下来,进行了HAdV-7候选疫苗的免疫学评价研究,评价不同形式的HAdV-7活病毒疫苗的在不同动物上的免疫效果。首先以BALB/c,C57 BL/6和金黄地鼠作为动物模型,肌肉注射和腹腔注射活的HAdV-7,结果显示:两种免疫途径均能检测到较高水平HAdV-7中和抗体,中和抗体在免疫后4周达到峰值,随后逐渐降低,但能长期维持一定的水平。然后以BALB/c小鼠作为动物模型,通过肌肉给药研究疫苗的免疫剂量依赖关系以及细胞免疫反应。结果显示:低剂量HAdV-7（1×105 IFU/只）能使50%的小鼠产生中和抗体,随着免疫剂量的增加中和抗体水平显著升高;利用流式细胞术检测HAdV-7免疫14天后的小鼠脾脏细胞,结果显示:只检测到特异性CD4+T细胞反应,未检测到特异性CD8+T细胞反应。最后,以恒河猴作为动物模型,通过肌肉注射活病毒和口服活病毒片剂的方式进行免疫,进行中和抗体和细胞免疫反应检测（流式细胞术和ELISPOT）。结果显示:肌肉免疫后能迅速激发体液免疫反应,中和抗体在14天左右达到峰值,随后显著降低但仍能长时间维持一定水平;口服给药组并未产生中和抗体。细胞免疫反应方面,肌肉注射组在免疫后7天,特异性CD8+T细胞反应（IFN-γ、TNF-α、IL-2和CD107a）和CD4+T细胞反应（IFN-γ、IL-2和CD154）显著上调,14天后显著下降;口服免疫途径并未检测到特异性的细胞免疫反应。我们推测HAdV-7活疫苗口服片剂无法顺利到达恒河猴的肠部释放并感染黏膜上皮细胞,从而无法进一步刺激机体产生免疫反应。综上所述,本研究建立的利用荧光素酶报告基因检测HAdV-7中和抗体的方法具有快速、灵敏、准确等优点,适用于HAdV-7血清流行病学调查以及相关疫苗研究的中和抗体检测。HAdV-7候选疫苗的免疫学评价研究发现肌肉注射免疫方式能够快速激发体液免疫反应和细胞免疫反应,然而口服活疫苗仍需进一步优化和研究。