【摘 要】
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目的:亨廷顿舞蹈病是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病,以舞蹈样不自主运动、伴进行性认知、精神障碍和痴呆为特征。其致病原因是位于4号染色体短臂上的HTT基因exon1处CAG序列的异常扩增。CAG扩增数超过39后表达的变异HTT蛋白通过不同的分子机制影响神经功能,HD发病后自噬功能的降低是变异蛋白累积的重要原因。雌激素及其受体在现有的研究中已被证实在大多情况下发挥着神经保护的作用,雌激素及其受体
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目的:亨廷顿舞蹈病是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病,以舞蹈样不自主运动、伴进行性认知、精神障碍和痴呆为特征。其致病原因是位于4号染色体短臂上的HTT基因exon1处CAG序列的异常扩增。CAG扩增数超过39后表达的变异HTT蛋白通过不同的分子机制影响神经功能,HD发病后自噬功能的降低是变异蛋白累积的重要原因。雌激素及其受体在现有的研究中已被证实在大多情况下发挥着神经保护的作用,雌激素及其受体通过自噬途径在癌症、心血管、代谢等领域也多有研究,但在神经系统中的作用特别是亨廷顿舞蹈病的研究仍知之甚少。本文拟在探究雌激素受体β与自噬之间的关系,雌激素受体β是否可以通过自噬在降解亨廷顿舞蹈病变异蛋白中发挥作用以及雌激素受体β调控自噬的相关机制。方法:1.通过多西环素的诱导,利用表达绿色荧光蛋白标记的HD基因第一外显子片段包含有23个（N-htt-Q23;两个独立的细胞系）或74个（N-htt-Q74;两个独立的细胞系）Poly Q重复序列的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞大鼠亨廷顿舞蹈病的正常与疾病组细胞模型并通过Western Blot和免疫荧光方法通过检测e GFP标记的N-htt-Q23和Nhtt-Q74的表达来对该模型进行评价。2.用Western Blot验证两组细胞中表达N-htt-Q23和N-htt-74本身对细胞自噬水平的影响。3.在过表达和敲低ERβ的条件下观察其对细胞自噬和对变异蛋白降解以及对自噬相关蛋白的影响,加用ERβ选择性配体DPN后进一步研究其对自噬的影响。4,利用生信分析预测ERβ与ATG5在m RNA水平和转录调控上的相关性;通过免疫共沉淀实验检测ERβ与ATG5之间的相互作用;通过双荧光素酶报告实验检测ERβ对于ATG5的转录调控作用。5.通过流式细胞术检测凋亡水平观察ERβ对N-htt-Q74细胞生物学功能上的影响。结果:1.成功建立以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞为基础的亨廷顿舞蹈病细胞模型,Western Blot和IF结果证实两组细胞Q23和Q74的相关蛋白分子量水平以及正常和变异HTT蛋白的形成。2.相比于N-htt-Q23,N-htt-Q74的表达使得细胞自噬的水平降低。3.过表达ERβ条件下,自噬激活,变异HTT蛋白降解,而在敲低ERβ后自噬被抑制。ERβ选择性配体DPN可进一步促进自噬,且对自噬的激活水平有剂量效应关系,P＜0.05。4.在蛋白和m RNA水平上均证实转染ERβ可上调ATG5的表达,敲低ERβ后上述现象被翻转;Co-IP证实ERβ与ATG5之间确实可以结合;双荧光素酶报告结果显示ERβ可以促进ATG5的转录活性,P＜0.05。5.转染ERβ后HD-PC12-Q74细胞凋亡水平降低,P＜0.05。结论:1.变异N-htt-Q74蛋白的表达抑制了细胞的自噬水平。2.ERβ对HDPC12-Q74细胞的自噬水平起上调作用。3.ERβ介导的自噬在降解变异亨廷顿蛋白的过程中发挥作用4.ERβ可与ATG5相互作用,并且ERβ可促进ATG5的转录5.ERβ对HD-PC12-Q74细胞起神经保护作用。
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