结直肠癌是世界上第三大常见的肿瘤,并且是世界上死亡率第四的肿瘤。每年大约有1,361,000人被诊断为结直肠癌患者,平均每年大约有694,000个病人死于结直肠癌。作为世界上最常见的肿瘤之一,结直肠癌可转移到肝、肺、腹膜等脏器中,是结直肠癌致死的重要因素。尽管近年来化疗及分子靶向治疗结直肠癌均取得了长足的进步,但临床上对其转移的治疗并没有实质性的突破,结直肠癌的预后仍然不容乐观。因此,进一步阐明结直肠癌侵袭转移的发生、发展及分子机制,仍然是目前针对其研究的重要方向。MicroRNA (miRNA)是细胞内广泛存在的非编码RNA,长度约为18-25个碱基。通常通过对mRNA进行切割及翻译抑制来调控靶基因的表达。MiRNAs在在多种重要的生命活动过程均扮演着重要的角色,如细胞增殖、凋亡及分化等。在过去的20年内,越来越多的文献报道MiRNAs参与肿瘤的发生发展,已有多种MiRNAs在肿瘤中检测到有异常表达,如乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌及卵巢癌等。MiRNAs在肿瘤中调节多种致癌基因或抑癌基因的表达,因此,研究MiRNAs在肿瘤中的具体功能将有助于增强对癌症的认知、诊断和治疗。MiR-34a是是miR-34a家族成员之一。MiR-34家族包含有3个成员,分别为miR-34a, miR-34b及miR-34c。近年来的文献报道显示MiR-34家族在多种肿瘤中通过靶向作用于多种靶基因,而扮演着肿瘤抑制因子的角色,MiR-34家族可调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移。在现有文献报道中miR-34家族在均扮演着肿瘤抑制因子的角色,已发现有多种肿瘤中有miR-34家族成员沉默的现象。近期报道显示在多种肿瘤中均有miR-34a的沉默现象,部分结直肠癌患者外血中miR-34a水平下调,然而,目前为止在结直肠癌中发现的miR-34a靶基因有且仅有两个,其在结直肠癌中的具体作用机制并没有详细的研究。本课题利用前期从结直肠癌组织中筛选出miR-34a作为结直肠癌相关miRNA,明确miR-34a在结直肠癌增殖、侵袭、转移中的作用,主要内容如下：(1)探讨miR-34a对结直肠癌生物学行为的影响；(2)预测及筛选miR-34a在结直肠癌中的作用靶基因,明确其在结直肠癌增殖、侵袭及转移中的作用。(3)检测miR-34a在结直肠癌临床标本中的表达,分析其与临床指标的关系并分析miR-34a在结直肠癌中与靶基因的相关关系。本课题旨在揭示miR-34a在结直肠癌中的作用机制,筛选并验证其作用靶点,为临床抗结直肠癌侵袭、转移提供新的miRNA和基因靶点。研究方法1、miR-34a对结直肠癌生物学行为的影响(1) miR-34a在6株结直肠癌细胞中的内源性检测：荧光定量PCR检测miR-34a在6株结直肠癌细胞SW480、HT29、LOVO、HCT116、SW620、LS174T中的内源性表达,筛选出高表达及低表达的细胞株分别用作后续干扰以及过表达实验。(2)购买商品化的miR-34a inhibitor及mimics片段,瞬时转染结直肠癌细胞株,利用荧光定量PCR验证miR-34a干扰及过表达效率以备后续实验。(3)利用CCK8、Boyden小室侵袭实验、细胞周期、细胞凋亡检测实验检测干扰及过表达miR-34a后对结直肠癌细胞增殖、迁移、周期及凋亡等生物学行为所产生的影响。(4)购买商品化miR-34a过表达慢病毒包装,进行病毒包装,感染至结直肠癌细胞株SW480中,利用荧光定量PCR验证其过表达效率。(5)观察miR-34a过表达后对结直肠癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。(6)观察miR-34a过表达后对结直肠癌细胞裸鼠体内转移能力的影响。2、miR-34a作用靶基因的预测、筛选及验证。(1)以miR-34a为检索词,在miRanda、TargetScan、DIANA-microT、Pictar4个数据库进行miR-34a的作用靶基因预测,将4个数据库的预测结果取交集,即预测得到的可信度和准确性较高的相关miRNA靶基因。(2)构建靶基因3’UTR区双荧光素酶报告质粒。(3)双萤光素酶报告系统验证筛选miR-34a靶基因。(4) Western-blot检测过表达及干扰miR-34a后靶基因的蛋白表达变化,进一步验证及确认miR-34a靶基因。(5)在结直肠癌细胞株中过表达miR-34a后,恢复靶基因的表达,通过CCK8、Boyden小室侵袭实验、细胞周期、细胞凋亡实验检测靶基因是否可有效逆转miR-34a对结直肠癌增殖、侵袭的抑制作用。3、miR-34a及FMNL2/E2F5在结直肠癌组织中的表达及相关性分析(1)荧光定量PCR检测30对配对新鲜结直肠癌组织中miR-34a的表达,比较其在结直肠癌组织及周围正常肠黏膜组织的区别,并分析miR-34a表达量与各项临床指标的关系。(2) Western-blot检测30对配对结直肠癌组织中miR-34a靶基因的表达,比较其在结直肠癌组织及周围正常肠黏膜组织的区别。(3)分析30对配对结直肠癌组织中miR-34a与其靶基因的相关关系。研究结果1、miR-34a抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭及转移(1)荧光定量PCR结果显示,在6株结直肠癌细胞中,miR-34a表达水平存在显著差异(F=767.9,P<0.0001),在HCT116细胞株中miR-34a表达量最高,,SW480次之,HT29及LS174T居中,而在LOVO细胞株中其表达量则最低,根据以上结果,我们选择了对HCT116和SW480细胞进行干扰miR-34a, SW480和LOVO细胞过表达miR-34a处理,以进行后续研究。(2)在miR-34a高表达的HCT116细胞株及SW480中瞬时转染miR-34a inhibitor片段,在miR-34a低表达的LOVO细胞株及SW480中瞬时转染miR-34a mimic片段后,荧光定量PCR结果显示干扰效率分别为0.324,0.136(p<0.001,p<0.001)；过表达效率分别为3.824、3.658(p=0.0069,p<0.001)。二者均为有效干扰片段及过表达片段。(3)CCK8结果显示：在HCT116及SW480中干扰miR-34a后结直肠癌细胞增殖能力显著增强(P<0.·001,P<0.001)；而在过表达miR-34a后,LOVO, SW480两株结直肠癌细胞增殖能力与NC组相比,亦存在显著差异(P<0.001,P<0.001)。(4)Boyden侵袭小室结果显示：与NC组相比,miR-34a inhibitor组SW480及HCT116细胞穿膜数目均显著降低(t=7.165, P=0.002;t=4.562, p=0.0103).而与NC组相比,过表达miR-34a后LOVO及SW620细胞的穿膜数目显著上调(t=3.539, P<0.00224;t=6.379, p=0.031).以上提示miR-34a可以抑制结直肠癌细胞的体外侵袭能力。(5)细胞周期实验结果显示：与NC组相比,miR-34a组G1期的细胞比例明显增加(t=-5.477, P=0.012;t=8.951,p=0.001); S期的细胞比例明显减少(t=3.687, P=0.0211;t=9.39,p<0.001); G2/M期的细胞比例明显增加(t=2.665,P=0.021, t=8.48, p=0.001); miR-34a inhibtor组与NC组相比,G1期的细胞比例明显减少(t=9.825, P= 0.0102;t=6.075, p=0.026); S期的细胞比例明显增加(t=-4.838, P=0.0402, t=16.27, p=0.0037); G2/M期的细胞比例明显减少(t=17.63,<0.001;t=14.01,p=0.005);提示miR-34a能抑制癌细胞从G1向S期演进,从而抑制细胞增殖能力。(6)细胞凋亡实验结果显示：与LOVO/NC及SW480/NC组相比,LOVO/miR-34a及SW480/miR-34a组早期细胞凋亡率明显升高(t=113.1,P<0.001；t=300,P<0.001：图2-6表1-11)。而与SW480/NC、HCT116/NC组相比,SW480/miR-34a inhibitor、HCT116/miR-34a inhibitor组早期细胞凋亡率明显下调(t=25.73, P<0.01; t=50.61,p<0.001;图2-6表1-12),表明miR-34a能促进结直肠癌细胞凋亡的发生。(7)成功构建SW480/miR-34a稳定株,荧光定量PCR验证其过表达效率为17.41(t=22.04,p<0.001)。(8)裸鼠皮下成瘤实验结果显示：miR-34a组皮下肿瘤直径较对照组明显减少(t=3.244,P=0.018)；且SW480/miR-34a组皮下肿瘤的Ki67阳性细胞百分比明显低于对照组SW480/NC (t=30.07, p<0.001;图2-8B),以上结果表明miR-34a抑制肿瘤细胞的体内增殖能力。(9)裸鼠尾静脉转移实验结果表明：两组中裸鼠仅在肺脏表面则可见明显的转移灶。SW480/NC组中裸鼠肺脏转移率为100%(6/6), SW480/miR-34a组的肺脏转移率为66.6%(4/6); SW480/miR-34a组发生肺转移灶的数目明显少于对照组(t=2.789,P=0.0164),提示miR-34a可抑制结直肠癌细胞的体内转移能力。2、miR-34a通过FMNL2及E2F5抑制结直肠癌的增殖、侵袭(1)以miR-34a为检索词,在miRanda、TargetScan、DIANA-microT、Pictar4个数据库进行miR-34a的作用靶基因预测,得出其可能的靶基因FMNL2、E2F5、 MET、DLL1、NAV3。(2)荧光素酶报告系统结果显示:miR-34a与FMNL2-3’UTR及E2F5-3’UTR结合后的荧光素酶活性均显著降低(F=21.75, P=0.0018, F=6.851, P=0.028; F=17.23, P=0.003, F=14.23, P=0.029),而另外3个预测靶基因MET、DLL1及NAV3双萤光素酶活性则无显著变化(p>0.05)证明miR-34a能与FMNL2及E2F5基因3’UTR区结合,从而抑制了萤光素酶的活性。(3) Western-blot结果显示：过表达miR-34a后,FMNL2及E2F5蛋白表达水平下降,而在干扰miR-34a后,靶基因FMNL2及E2F5蛋白表达水平均上调了。进一步表明FMNLE及E2F5为miR-34a在结直肠癌中的靶基因。(4)用CCK-8检测SW480细胞株中NC组、miR-34a组、miR-34a/FMNL2组以及miR-34a/E2F5体外增殖能力变化同时绘制生长曲线。析因方差分析统计结果显示：与NC组对比,miR-34a组的增殖速度明显降低(P<0.001),而miR-34a/FMNL2组及miR-34a/E2F5组能有效逆转miR-34a对结直肠癌细胞的抑制增殖作用(P<0.001；P<0.001),结果表明,miR34通过作用于靶基因FMNL2及E2F5抑制结直肠癌细胞的增殖能力,而FMNL2与E2F5能有效逆转其对结直肠癌细胞增殖能力的抑制作用。(5) Boyden Transwell小室检测NC、miR-34a mimic; miR-34a/FMNL2及miR-34a/E2F5细胞体外侵袭能力,结果显示miR-34a/FMNL2组及miR-34a/E2F5均能有效逆转miR-34a对结直肠癌细胞的抑制侵袭作用(F=202,P<0.001；F=218,P<0.001。(6)流式细胞仪检测NC、miR-34a mimic; miR-34a/FMNL2及miR-34a/E2F5对细胞的细胞周期影响,独立样本T检验分析显示：在SW480过表达miR-34a后,miR-34a组与NC组相比,G1期的细胞比例明显增加；S期的细胞比例明显减少；G2/M期的细胞比例明显增加；在过表达miR-34a并恢复FMNL2及E2F5表达后,G1期的细胞比例明显减少(p<0.001,p<0.001)；S期的细胞比例明显增加(p=0.001,p<0.001)；G2/M期的细胞比例明显减少(p=0.005,p<0.001；提示miR-34a能抑制癌细胞从G1向S期演进,从而抑制细胞增殖能力,而FMNL2及E2F5可有效逆转miR-34a对结直肠癌细胞的周期阻滞作用。(7)流式细胞仪检测NC、miR-34a mimic; miR-34a/FMNL2及miR-34a/E2F5对结直肠癌细胞凋亡的影响。结果显示,与SW480/NC相比,SW480/miR-34a组早期细胞凋亡率明显升高,而在过表达miR-34a的同时恢复FMNL2/E2F5的表达,则可有效逆转miR-34a对结直肠癌细胞的促凋亡作用(F=1867,p<0.01,F=384.1,p<0.001)。3、miR-34a及FMNL2/E2F5在结直肠癌组织中的表达及相关性分析(1)荧光定量PCR结果显示：在30对配对结直肠癌组织中,miR-34a在结直肠癌组织中表达明显低于正常黏膜组织(t=2.336,p=0.0241)。临床病理分析显示：miR-34a与患者年龄、性别、肿瘤大小,浆膜浸润、肿瘤分化以及Duke分期均没有统计学上的相关性(p>0.05),而与淋巴结转移存在相关性(t=-1.727,p=0.01)。(2) Western Blot结果显示：FMN2、E2F5在30对配对结直肠癌组织中的表达明显上调。(3) Spearman相关性分析结果显示,miR-34a与FMNL2及E2F5在结直肠癌中表达均呈负相关关系(r=-0.971, P<0.0001; r=-0.9216, P<0.001).结论1、MiR-34a可以抑制结直肠癌的增殖、侵袭及转移。2、MiR-34a在结直肠癌中的直接作用靶基因为FMNL2及E2F5, miR-34a通过FMNL2及E2F5抑制结直肠癌细胞增殖和侵袭能力。3、MiR-34a在结直肠癌组织中表达下调,而FMNL2及E2F5表达上调；miR-34a与FMNL2及E2F5在结直肠癌中均呈表达负相关。