金黄色葡萄球菌是可以引发从皮肤炎症、肺炎到休克综合症等一系列疾病的革兰氏阳性致病菌,其通过表达各种表面粘附蛋白和毒力因子如溶血素、蛋白酶等引发各种疾病。金葡菌的治疗目前临床上多采用联合使用抗生素的办法,但由于金葡菌抗药性问题不能解决,致使许多抗生素变的无能为力。sRNA(small RNA)是真核和原核细胞中广泛存在的一类非编码RNA,真核细胞中的sRNA-microRNA与靶基因互补调节特定基因的表达。在细菌中也存在类似的非编码小RNA,这一种sRNA通过互补配对与靶mRNA的5’UTR相互作用,影响靶mRNA的稳定性和翻译。一个sRNA可以与多个靶基因配对,同时多个sRNA也可以作用于同一个靶基因,它们发挥作用依赖于RNA伴侣分子Hfq (a host factor for RNA phage Qβ)。已有的研究结果表明,sRNA在细菌生长代谢及毒力调控过程中发挥着重要的作用。目前有关sRNA的研究主要集中于大肠杆菌(Escherichia coli),新近的研究结果表明在革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及单核细胞增多性李司特菌(Listeria monocytogenes)中也发现了新的sRNA,其中部分位于细菌基因组的病原岛或者为致病菌株特有,提示这些sRNA可能参与了致病菌毒素的表达调控。金葡菌RNAIII(一种sRNA)已经被证实作用于多个毒力相关基因参与调控金葡菌的致病性。具有RNA伴侣分子活性的Hfq蛋白最早在大肠杆菌中发现,其主要的生物学功能是通过形成六聚体与RNA结合来影响RNA的稳定性或者是通过辅助非编码小RNA与mRNA结合来调节靶基因的表达。目前在大肠杆菌中,超过30%的非编码小RNA能够与Hfq蛋白结合。Hfq蛋白本身具有ATPase活性,能够加速转录及翻译过程。大肠杆菌hfq的无义突变能够影响一系列蛋白的表达,导致细菌表型发生较大的变化,研究表明Hfq蛋白还能够影响多种细菌外毒素表达。在Hfq发挥其生物学功能的过程中有多种蛋白的参与,例如PNP(polynucleotide phosphorylase)、PAPI(polyA polymerase I)以及RNaseE等通过与Hfq蛋白的结合来调控靶基因的表达。核糖体蛋白S1与RNAP (RNA polymerase)之间的结合也需要Hfq蛋白辅助,Hfq蛋白在这些蛋白发挥调控功能的过程中发挥着广泛而重要的作用。本研究选择了金葡菌Hfq蛋白为主要研究对象,通过寻找和鉴定与其相互作用的蛋白质及其调控的RNA分子,阐明了Hfq蛋白在金葡菌中的重要生物学功能。本论文的主要研究内容包括①金葡菌hfq突变株制备及相关检测;②Hfq蛋白聚体形式及其伴侣分子活性的研究;③与Hfq相互作用蛋白质的寻找;④Hfq调控的RNA分子的寻找及其调控功能的研究。本研究所获得的具体结果如下: 1、金葡菌hfq突变株制备及相关检测。通过基因重组的方法获得hfq的突变体菌株,突变体对动物的致病性明显降低。基因芯片和蛋白质组的结果表明Hfq蛋白可以影响金葡菌内多个编码基因的表达。同时我们还发现多个基因间区的转录水平发生改变。由于细菌中的sRNA大多由基因间区转录,这表明Hfq蛋白通过调控功能基因和sRNA在金葡菌内的水平,来发挥其生物学作用。2、Hfq蛋白聚体形式及其伴侣分子活性的研究。我们克隆表达了金黄色葡萄球菌来源的Hfq蛋白,并检测了不同理化条件下重组蛋白的聚体稳定性。研究结果发现重组蛋白在体外可以形成二聚体、四聚体和六聚体形式,进一步的结果表明不同聚体形成的机制可能不同。同时我们利用氨基酸替代的方法研究发现56位和63位酪氨酸是Hfq蛋白形成稳定的六聚体形式的关键氨基酸。RNA结合实验结果表明突变体蛋白不能够与RNA结合,从而证实Hfq蛋白的聚体形式是发挥其RNA伴侣分子功能的关键。3、与Hfq相互作用蛋白质的寻找及鉴定。我们在实验中发现,TRAP(target of RAP)蛋白与聚体形式Hfq蛋白特异结合。TRAP是金葡菌内与其致病性相关的蛋白分子,TRAP抗体对金葡菌外毒素的产生以及对动物的致病性有着明显的抑制作用,但是其具体作用方式还存在争议。我们的实验结果表明TRAP蛋白通过C末端与Hfq结合,并可以稳定Hfq蛋白聚体形式。trap和hfq突变菌株致死性明显降低,芯片及双向电泳结果也显示trap和hfq突变菌株中存在一些共同变化的基因和外分泌蛋白,这提示两种蛋白的相互作用可能会通过调控一些基因的表达影响金葡菌的致病性。已有文献报道RNaseIII参与了RNAIII与spa mRNA所形成的复合体中mRNA的降解,我们在体外实验中发现,RNaseIII可以与Hfq结合,二者结合后RNaseIII不能降解RNA,提示Hfq与RNaseIII的相互作用可能影响RNA在金葡菌中的代谢。4、Hfq调控的RNA分子的寻找及其调控功能的研究。首先我们利用免疫共沉淀的方法证实了Hfq以聚体形式与RNAIII结合,在此基础上我们建立了一种新的免疫共沉淀类似的方法-IPL(Immunoprecipitation-Like),利用该方法钓取了RNAIII作用的靶基因,结果显示spa和hla mRNA是RNAIII的靶分子,这与文献报道相一致,同时我们还发现多个与金葡菌毒力相关的基因也是RNAIII的靶分子。ssrA又称为tmRNA或10saRNA,是细菌中高度保守的一种sRNA分子,其主要的生物学功能是通过行使tRNA和mRNA的双重功能,使合成停滞或者中断的蛋白质被迅速释放并降解。与hfq突变体相似,ssrA突变体的表面颜色明显加深,凝胶阻滞及免疫共沉淀实验也表明,在Hfq辅助下ssrA可以直接调节色素相关基因crtMNmRNA的表达,或通过调节sigB蛋白的表达间接影响金葡菌表面色素的调控,揭示了在金葡菌中ssrA不仅可以行使tmRNA功能,还可以在Hfq蛋白辅助下,作为一种sRNA来调控不同靶基因的表达,影响金葡菌表面色素的合成。利用IPL的方法,我们寻找到一些新的与Hfq结合的sRNA分子,并通过RACE的方法找到两条新的全长sRNA,分别命名为IP1和IP3,在不同培养条件下这两条sRNA表达上调,提示这两种sRNA与金葡菌应激反应相关,同时我们发现两种sRNA可能分别作用于多个靶基因。总之,本研究在阐明Hfq蛋白对金葡菌致病性的重要影响以及聚体形式对其RNA伴侣分子活性具有重要作用的基础上,寻找并鉴定了与其相关的蛋白和RNA分子,进一步研究了其在金葡菌中的分子生物学功能。Hfq蛋白在金葡菌中生物学功能的阐明有助于加深对金葡菌致病性的了解认识,为抗金葡菌感染提供更为深入的理论基础和新的药物靶标,也会为其它抗微生物感染的研究提供参考和借鉴。