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研究背景胰腺癌起病隐匿,恶性程度极高,已经成为我国居民面临的极其紧迫的健康问题之一。虽然手术精细化、微创化迅猛发展,吉西他滨、卡培他滨、纳米紫杉醇、S-1、纳米脂质体伊立替康以及FOLFIRINOX等化疗方案层出不穷,但胰腺癌五年生存率依然不足10%。胰腺癌分子机制复杂,目前公认的四大驱动基因包括KRAS、TP53、SMAD4和CDKN2A,涉及多条信号通路的改变,其中MAPK通路(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)是胰腺癌中已经被证明的核心信号通路之一。丝裂原活化蛋白激酶激酶 4(mitogen-activated protein kinase kinase 4,MKK4)和丝裂原活化蛋白激酶激酶 7(mitogen-activated protein kinase kinase 7,MKK7)是 MAPK 信号通路的关键信号分子。在人胰腺癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌和结直肠癌等多种恶性肿瘤中均发现了MKK4基因的缺失和突变,但是MKK4在胰腺癌中的作用尚存在着争议,MKK4究竟发挥促癌还是抑癌作用,其影响胰腺癌的发生发展的相关机制有待进一步阐明。MKK7可抑制肺癌和乳腺癌的发生发展,在胰腺癌中,MKK7报道很少,鲜有的几篇文献提示MKK7可能在胰腺癌中起抑癌作用,但是缺乏对胰腺癌中MKK7作用的系统完整阐述。因此探究MKK4、MKK7对胰腺癌预后和恶性生物学行为的影响有着重要的意义,有望为胰腺癌的治疗提供新的潜在治疗靶点。研究目的探究MKK4、MKK7在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理指标和预后的关系,并探索MKK4、MKK7对胰腺癌细胞增殖、侵袭迁移等恶性生物学行为的影响。研究方法1、基于Oncomine数据库、TCGA数据库等分析MKK4、MKK7在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达差异及其与胰腺癌临床病理指标和预后的关系。2、通过免疫组化技术检测MKK4、MKK7在胰腺癌组织以及癌旁组织中的表达水平,结合患者的临床病理信息及预后随访资料,探讨MKK4、MKK7的表达与患者临床病理指标和预后的关系。3、利用siRNA转染下调MKK4、MKK7在胰腺癌细胞中的表达后,使用CCK-8法检测胰腺癌细胞的增殖能力;使用Transwell实验检测胰腺癌细胞侵袭和迁移能力;利用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;利用Western Blot检测细胞增殖相关蛋白水平的变化以探索其可能的调控机制。研究结果1、利用生物信息学分析MKK4/MKK7在胰腺癌组织中的表达及预后价值通过分析Oncomine数据库、TCGA数据库发现,mRNA、DNA水平上MKK4、MKK7在胰腺癌中癌和正常的差异分析结果在不同数据集不完全一致,大部分的数据集分析结果显示胰腺癌中MKK4、MKK7的表达水平低于正常胰腺组织。TCGA数据库中MKK4、MKK7高表达组患者生存时间显著长于低表达组,而且在多个亚组中均显现出强大的预后价值。2、MKK4/MKK7在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理指标和预后的关系胰腺癌组织细胞质MKK4、MKK7的表达水平较癌旁组织显著下调,而细胞核的MKK4表达水平在癌组织中显著上调。细胞质MKK4和MKK7的表达水平与组织学分级呈显著负相关,细胞质MKK4表达与术前血CA19-9水平也呈显著负相关。单因素分析中,细胞质MKK4高表达患者的生存期明显长于MKK4低表达患者,但是在多因素Cox回归分析中没有统计学意义。联合分析MKK4、MKK7极大地提高了胰腺癌预后预测能力,而MKK4、MKK7、pN分期组合在胰腺癌中是独立的预后预测指标。3、MKK4/MKK7对胰腺癌细胞生物学行为的影响及分子机制初步探究在Mia PaCa-2和Panc-1胰腺癌细胞株中,瞬时敲减MKK4、MKK7可以显著促进胰腺癌细胞增殖及侵袭、迁移能力,但是未发现其对细胞凋亡的影响。我们发现敲减MKK4及MKK7后胰腺癌细胞的Cyclin A2蛋白表达量增加,而Cyclin B1、DUSP1、Cyclin D1均无明显变化。研究结论1、细胞质MKK4和MKK7表达量在胰腺癌组织中显著下调;2、MKK4高表达的胰腺癌患者生存期显著延长;3、MKK4联合MKK7及N分期可提高胰腺癌的预后预测效能;4、MKK4、MKK7均抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移,但不影响胰腺癌细胞的凋亡;5、Cyclin A2可能参与胰腺癌中MKK4、MKK7的相关分子机制。