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普瑞巴林(Pregabalin)是神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的衍生物,其作为第二代抗癫痫药物(Lyrica(?)),已被用于治疗多种中枢神经系统紊乱疾病,国内外市场需求和销量增势显著。(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯((5)-CNDE)是制备普瑞巴林的重要手性中间体。利用生物拆分法制备光学纯手性中间体(S)-CNDE是一条绿色、高效的路径,具有良好的的发展潜力和应用前景。本文从实验室前期筛选获得的具备较高选择性水解(S)-CNDE能力的菌株Pseudomonas CGMCC No.4184出发,通过构建基因文库,以CNDE作为底物,用平板水解圈法进行初筛并通过手性拆分反应进行复筛验证,成功获取了含有目的基因的DNA片段。经开放阅读框分析及亚克隆构建重组菌验证,确定了目的基因estZF172,并在大肠杆菌中成功实现了相应蛋白EstZF172的可溶性表达,其酶活为3,948.5 U g-1,较野生菌提高了425倍,拆分rac-CNDE的E值为95。氨基酸序列比对发现,序列中含四个保守区域,同时利用分子模拟分析其三维结构及数个重要氨基酸残基,并采取定点突变策略加以验证；再结合进化树分析和底物特异性测试等手段,确定EstZF172为酯酶,隶属酯酶/脂肪酶家族中的Family VIII,该家族成员与β-内酰胺酶和DD-肽酶的相似度极高,活性丝氨酸残基位于保守区域S-X-X-K中。以对硝基苯酚己酸酯为底物,对纯化后的酯酶进行酶学性质表征,确定了该酶的最适反应温度和pH分别为50℃、pH9.0(Tris-HCl缓冲液),而金属离子Co2+、Ni2+、Mn2+和Zn2+,巯基试剂AgNO3和CuSO4,以及表面活性剂SDS和Triton X-100等添加剂则对该酶有明显的抑制作用。在LB培养基中对该重组菌进行产酶条件优化,使酶活较优化前提高了21%。将重组全细胞应用于拆分外消旋的CNDE制备(S)-CNDE,确定了其过程转化温度为35℃,pH为8.5。随后考察了反应中的底物、产物抑制情况,并对影响转化的全细胞载量、底物浓度等因素进行了优化。在底物浓度为127.5 g L-1时,确定底物/细胞载量的质量最优比为38.8,实现了当转化率为52.3%时ees达到99.5%以上,时空产率为34.1 mmol L-1h-1。此外,添加适量的强碱性阴离子交换树脂CHA26107也能够有效减轻反应过程中的产物抑制。