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牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）为单股正链RNA病毒,属黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）。BVDV可存在于多种动物机体内并能够导致呼吸系统和消化系统疾病,在牛群及其周边环境中也普遍存在。BVDV进入机体后可造成持续性感染和免疫抑制,持续感染动物的血清抗体为阴性,却终身带毒并排毒,因此对养牛业及其他动物养殖业均造成了巨大的危害。在青藏高原地区,牦牛感染BVDV后导致腹泻,繁殖力降低,生长迟缓和继发感染其他疾病。近年来的流行病学调查显示,该病在西藏和青海地区均广泛流行。牦牛感染BVDV的情况十分普遍,但是关于牦牛BVDV分子方面的研究相对较少,因此,掌握青藏高原地区牦牛BVDV的病原流行情况和分子特征,对预防和控制该病具有重要的意义。本研究通过RT-PCR方法对青藏高原部分地区牦牛腹泻和临床健康的粪便样本进行BVDV的分子流行病学调查,并且从粪便样本中分离鉴定出两株CP型BVDV毒株;应用RT-PCR方法获得分离株的全基因序列,分析其遗传进化关系,取得的结果如下:1.2015-2016年青藏高原部分地区牦牛BVDV的分子流行病学调查及遗传进化分析2015-2016年从青藏高原部分地区（西藏、云南、青海、四川）采集牦牛腹泻和临床健康的粪便样本共计390份,利用RT-PCR方法对所采集的样品开展分子流行病学调查。结果表明BVDV在青藏高原地区普遍存在,总检出率为19.23%（95%CI=15.4%-23.5%）。腹泻样本的总检出率为25.52%（95%CI=19.5%-32.39%）,临床健康的牦牛粪便样本的总检出率为13.13%（95%CI=8.8%-18.6%）（p=0.002）,与近年来的流行病学调查结果相近。从四个地区平均的随机选取35份样本（14份来自临床健康牦牛和21份来自腹泻牦牛）分别基于5’-UTR,Npro基因和E2基因进行克隆测序,测序结果与GenBank中的参考序列进行比对,并基于5’-UTR,Npro基因和E2基因构建进化树,确定青藏高原部分地区20152016年牦牛BVDV流行的基因型和亚型。35份测序株的5’-UTR基因之间的核苷酸同源性为71.6%100%,与其他BVDV毒株的核苷酸同源性为69.1%90.9%。Npro基因之间的核苷酸和氨基酸序列分别为72.8%100%和74.7%99.3%,与其他BVDV毒株的Npro基因序列的核苷酸和氨基酸同源性分别介于74.9%87.5%和82.3%89.0%之间,E2基因之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为68.2%99.9%和66.8%99.5%,与其他BVDV毒株E2基因序列的核苷酸和氨基酸同源性分别介于68.2%97.8%和67.4%96.0%之间。基于5’-UTR构建的遗传进化树表明,31个测序株与BVDV-1d亚型的韩国毒株10JJ-SKR的遗传关系较近,但独自聚为一支,属于BVDV-1d亚型。Z3和Z6分离株与美国BVDV-1a亚型的GS5毒株遗传关系较近,而CB7和FB3分离株与德国BVDV-1b亚型的Osloss毒株遗传关系较近。即35个BVDV阳性样品属于BVDV-1a（n=2）,BVDV-1b（n=2）和BVDV-1d（n=31）,且基于Npro和E2基因构建的遗传进化树与5’-UTR的结果相同。结果表明,BVDV-1d为20152016年青藏高原部分地区牦牛BVDV主要的流行亚型。2.两株致细胞病变的BVDV毒株的分离鉴定将已经测序的35份牦牛粪便样本处理后接种于牛肾细胞（MDBK）中盲传3代后进行RT-PCR检测,BVDV检测均呈阳性,传至7代后,四川样本Z6（BVDV-1a）和青海样本DJ2（BVDV-1d）两个样本在70 h左右出现细胞病变,病变初期细胞出现圆缩的现象,逐渐出现拉网状并开始脱落,正常MDBK细胞作为阴性对照没有发生病变,通过噬斑实验纯化病毒3次,RT-PCR检测为BVDV阳性。初步确定分离到了两株致细胞病变（Cytopathic,CP）型BVDV,分别命名为SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015。按Reed-Muench法对两株分离株的效价进行计算,结果显示,该两株分离株SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015第9代细胞毒的TCID50/100μL分别为10-8.11和10-5.81。通过间接免疫荧光实验检测,显微镜下观察可见,两株分离株均出现了与阳性参考毒株Oregon C24V相似的明亮的特异性绿色荧光,而阴性对照则未出现绿色荧光,说明成功分离到两株BVDV CP型毒株。3.SMU-Z6/1a/SC/2016与SMU-DJ2/1d/QH/2015的全基因扩增与遗传进化分析为了进一步了解牦牛源BVDV的基因组信息,根据GenBank已公布的BVDV全基因序列,利用Primer 6.0软件设计10对引物,通过PCR方法扩增SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015的全基因序列,利用DNAstar等软件拼接序列。SMU-Z6/1a/SC/2016的全基因组长度为12,178 bp,G+C含量为47.0%,ORF为11,703 bp编码3884个氨基酸,5’-UTR和3’-UTR分别长300 bp和175 bp。SMU-DJ2/1d/QH/2015的长度为12,255 bp,G+C含量为45.6%,编码3897个氨基酸,5’-UTR和3’-UTR分别长374 bp和190 bp。SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015与其他BVDV毒株的ORF的核苷酸及氨基酸同源性分别为68.4%?89.8%/67.1%?84.4%和71.8%?97.3%/70.7%?90.5%。在比较BVDV-1a毒株的序列中,SMU-Z6/1a/SC/2016的E2糖蛋白编码区变异情况比较大,与其他BVDV-1a毒株的E2基因核苷酸及氨基酸同源性分别为78.6%?88.8%/72.9%?78.3%。结果表明,SMU-Z6/1a/SC/2016的抗原性可能与其他BVDV-1a毒株具有明显差异,可能是新型病毒。而SMU-DJ2/1d/QH/2015与其他BVDV-1d毒株的E2基因核苷酸及氨基酸同源性分别为97.2%?97.8%/95.7%?96%,无明显差异。此外,CP型的病毒能够通过内部加工将NS2-3蛋白裂解为NS2和NS3蛋白,NS3蛋白是CP型BVDV在蛋白水平的分子标记。SMU-Z6/1a/SC/2016的NS3区域与其他BVDV-1a毒株相比显示出明显的变化。我们确定了SMU-Z6/1a/SC/2016毒株NS3基因中存在49个有意突变和62个无意突变,导致47个氨基酸变化和1个氨基酸缺失。SMU-Z6/1a/SC/2016的NS3区域的变异可能会影响毒力和毒株的致病性。而SMU-DJ2/1d/QH/2015毒株的变化则相对较小。为了确定两个毒株之间的遗传进化关系,我们将SMU-Z6/1a/SC/2016与SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株与25株BVDV毒株的E2基因及全基因建立系统发育进化树,分析显示SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株与BVDV-1d型10JJ-SKR的同源性较高,亲缘关系较近,但SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株单独位于一支上,属于BVDV-1d型。SMU-Z6/1a/SC/2016分离株与BVDV-1a型OregonC24V和NADL的同源关系较近,位于同一分支上,而BVDV OregonC24V和NADL毒株均为毒力较强的CP型BVDV疫苗毒株。