目的:肾小管间质炎症(TI)是肾脏病的重要病理特征,可导致肾小管间质纤维化(TIF)。作为肾损伤最常见的原因之一,缺氧是导致TI的关键原因。缺氧引起的肾小管上皮细胞(TECs)损伤可以诱导肾小管间质巨噬细胞浸润。但缺氧TECs引起巨噬细胞活化的分子机制仍不十分清楚。低氧诱导因子-1(HIF-1)是调节机体低氧适应的关键转录因子。在肾脏中,表达于TECs的HIF-1α是低氧应激的主要调节因子。而TECs HIF-1α是否通过TECs-巨噬细胞的相互作用介导低氧诱导的TI尚不清楚。外泌体是细胞分泌的、大小在30到150nm之间的细胞外囊泡。其可以通过转移mi RNA将信息传递到受体细胞。因此,缺氧导致的TECs HIF-1α能否通过外泌体转移mi RNA促进TI形成需要进一步探讨。氧依赖性的脯氨酰羟化酶(HIF-PHD)作为调节HIF的关键酶成为治疗相关疾病的新靶点。HIF-PHD抑制剂(HIF-PHI)主要通过模拟HIF-PHD缺氧后功能抑制,稳定HIF表达发挥作用。证据表明,HIF-PHI可以剂量依赖性的活化HIF-α。尽管在治疗肾性贫血的临床试验中,HIF-PHIs显示出良好的有效性和安全性,但由于反复或持续的HIF活化,仍存在一些潜在的非红细胞生成效应。研究显示,HIF-1α的持续活化可导致TIF。MK-8617(MK)是最近发现的一种口服生物活性的HIF-PHI,能有效刺激红细胞生成,但长期使用是否会通过持续诱导HIF-1α活化而对CKD小鼠TIF产生影响以及相关机制有待阐明。本研究目的在于:通过一系列体内外实验探讨缺氧导致的TECs HIF-1α表达能否通过外泌体转移mi RNA促进TI形成;并进一步探讨长期使用不同剂量HIF-PHI(MK-8617)诱导的HIF-1α活化对CKD小鼠TIF的影响及机制。本研究包括四个部分:第一部分:肾小管间质炎症与缺氧所致TECs HIF-1α表达和外泌体mi RNA-23a的关系研究方法:构建肾脏缺血/再灌注(I/R)损伤和单侧输尿管梗阻(UUO)模型。模型构建后的第1天、第3天和第7天处死小鼠,收集尿液、血清和肾脏标本进行肾功能分析,病理和免疫染色以及分子生物学实验。使用差速离心法提取肾组织和小管组织分泌的外泌体。将mi RNA-23a inhibitor导入I/R损伤小鼠肾脏,24小时后处死,获取其尿液、血清和肾脏标本进行肾功能分析,病理和免疫染色以及分子生物学实验。结果:在I/R损伤和UUO模型中,观察到肾小管间质中F4/80+巨噬细胞浸润在第1天和第3天明显增加;同时,肾组织中炎症细胞因子(单核细胞趋化蛋白-1、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β)的m RNA和磷酸化的NF-κB p65(p-p65)表达亦显著增加,在第7天则显著降低。肾脏中HIF-1α的m RAN和蛋白表达在第1天和第3天显著增加,在第7天则显著降低。同时,在I/R损伤和UUO肾脏外泌体中,mi RNA-23a在第1天和第3天高度富集,而在第7天,其表达则显著降低。此外,I/R损伤小管分泌的外泌体亦富含mi RNA-23a。在I/R损伤模型中,敲降mi RNA-23a可以显著缓解肾组织中F4/80+巨噬细胞浸润,炎症细胞因子m RNA和p-p65的表达。结论:TI与缺氧所致TECs HIF-1α表达和外泌体mi RNA-23a具有时间相关性。mi RNA-23a对缺氧引起的TI起至关重要的作用。第二部分:HIF-1α介导的外泌体mi RNA-23a促进TI形成的机制探讨方法:使用差速离心法提取TECs分泌的外泌体。使用si RNA干扰抑制HIF-1α表达水平。使用染色质免疫沉淀-PCR(Ch IP-PCR)探讨HIF-1α与mi RNA-23a表达的关系。使用mi RNA-23a inhibitor或mimic抑制或过表达外泌体mi RNA-23a水平。采用荧光报告素酶实验检测mi RNA-23a与A20之间的相互作用。将缺氧TECs分泌的外泌体和mi RNA-23a敲降的外泌体注射到小鼠肾脏内(10μg外泌体溶于60μl PBS中),获取肾脏进行病理和免疫染色以及分子生物学实验。结果:缺氧处理的TECs中HIF-1α,p-p65和外泌体mi RNA-23a表达显著增高。Ch IP-PCR分析显示,缺氧的TECs HIF-1α与mi RNA-23a启动子结合。与对照组外泌体相比,缺氧TECs分泌的外泌体可显著活化巨噬细胞。此外,缺氧TECs表达的mi RNA-23a可以通过外泌体转移到巨噬细胞。使用mi RNA-23a mimic或inhibitor过表达或敲降mi RNA-23a,外泌体mi RNA-23a过表达可显著增加巨噬细胞浸润、p-p65和炎症细胞因子m RNA的表达,该现象可以被mi RNA-23a敲降的外泌体显著缓解。此外,我们证明外泌体mi RNA-23a直接通过靶向抑制A20导致巨噬细胞活化。体内研究发现,肾组织中mi RNA-23a主要定位于CD68+巨噬细胞和TECs中。当注射富含mi RNA-23a的外泌体时,小鼠肾脏的巨噬细胞浸润、p-p65和炎症细胞因子m RNA的表达显著增加,而注射敲降mi RNA-23a的外泌体则可明显缓解肾脏巨噬细胞浸润、p-p65和炎症细胞因子m RNA的表达。结论:缺氧引起的TECs HIF-1α可以转录性表达mi RNA-23a,后者通过外泌体转移至巨噬细胞,靶向抑制A20、激活NF-κB通路,活化巨噬细胞而引起TI。第三部分:HIF-1α活化对CKD小鼠TIF的影响方法:5/6肾大部切除建立CKD小鼠模型,8周后,给予小鼠[DMSO/PEG400/水(5:40:55,v/v/v)]或MK-8617(一种新型HIF-PHI,1.5、5或12.5 mg/kg/d)灌胃,灌胃12周后处死小鼠,获取其尿液、血液和肾脏进行肾功能分析,血红蛋白(Hb)水平检测,病理和免疫染色以及分子生物学实验。结果:MK可以剂量依赖性的稳定HIF-α表达。HIF-1α活化对CKD小鼠肾功能具有浓度依赖性的双向作用。与对照组CKD小鼠相比,HIF-1α低度(1.5mpk)或中度活化(5mpk)小鼠的血清SCr、BUN和ACR显著降低,而HIF-1α高度活化(12.5mpk)小鼠则显著增加。此外,HIF-1α活化对CKD小鼠TIF具有浓度依赖性双向作用。与对照组CKD小鼠相比,HIF-1α低度(1.5mpk)或中度活化(5mpk)小鼠的肾脏细胞外基质蛋白α-SMA、I型胶原蛋白和纤连蛋白表达显著降低,而HIF-1α高度活化(12.5mpk)小鼠则显著增加。结论:HIF-1α活化对CKD小鼠TIF具有浓度依赖性的双向作用,即HIF-1α低中度活化可缓解CKD小鼠TIF,HIF-1α过度活化则促进CKD小鼠TIF。第四部分:肾小管上皮细胞HIF-1α过度活化促进CKD小鼠TIF的机制探讨方法:采用基因组测序探讨MK干预HK-2细胞的m RNA基因表达谱模式特征,使用SOMs分析转录组数据表达特征。使用Ch IP-PCR探讨HIF-1α与KLF5表达关系。使用KLF5 si RNA抑制KLF5表达水平。尾静脉注射以KLF5为靶标的sh RNA慢病毒以建立KLF5基因敲降小鼠。给予KLF5基因敲降小鼠MK-8617(12.5 mg/kg/d)灌胃,灌胃10周后处死小鼠,收集其尿液、血清和肾脏进行肾功能分析,病理和免疫染色以及分子生物学实验。结果:HIF-1α过度活化(500和1000 n M)可显著促进HK-2细胞的α-SMA、I型胶原蛋白和纤连蛋白表达。通过全基因组测序分析,HIF-1α过度活化的HK-2细胞中KLF5基因表达明显上调。Ch IP-PCR分析表明,HIF-1α过度活化的TECs HIF-1α与KLF5启动子结合。此外,HIF-1α过度活化(12.5mpk)小鼠肾脏的TGF-β1表达亦明显升高,KLF5 si RNA可以通过抑制TGF-β1表达而减轻细胞外基质蛋白α-SMA、I型胶原蛋白和纤连蛋白表达。体内实验发现,KLF5基因敲降可显著缓解细胞外基质蛋白α-SMA、I型胶原蛋白和纤连蛋白表达。结论:TECs HIF-1α过度活化通过激活HIF-1α-KLF5-TGF-β1信号通路促进CKD小鼠TIF。全文结论:1.缺氧是引起肾脏TI的重要原因,缺氧引起的TI与TECs HIF-1α和外泌体mi R-23a有时间相关性,mi RNA-23a在缺氧诱导的TI中发挥重要作用。靶向抑制mi RNA-23是治疗肾脏缺氧损伤的新靶点。2.肾脏缺氧损伤后,TECs HIF-1α通过调节外泌体mi RNA-23a表达,促进巨噬细胞NF-κB通路活化而引起TI发生。3.HIF-1α活化对CKD小鼠TIF具有浓度依赖性的双向作用。4.HIF-1α-KLF5-TGF-β1信号通路激活是HIF-1α过度活化诱导TIF的重要机制。本研究的创新之处:1.发现缺氧引起的TI与TECs HIF-1α和外泌体mi RNA-23a有时间相关性,HIF-1α通过调节外泌体mi RNA-23a表达促进巨噬细胞NF-κB通路活化而引起TI发生。2.首次阐明HIF-PHI MK-8617诱导的TECs HIF-1α活化呈现对CKD小鼠TIF浓度依赖性的双向作用。HIF-1α过度活化引起的CKD小鼠TIF加重与HIF-1α-KLF5-TGF-β1信号通路激活有关。