背景:m RNA加工过程作为RNA领域的研究热点,涵盖了m RNA剪接,5’端加帽,3’端加尾,碱基修饰,选择性加工以及转运出核等步骤,其中m RNA转运出核机制作为决定基因表达的不可或缺的一步,其机制的研究中存在着许多尚未解决的难题。在高等生物m RNA成熟的过程中,m RNA的出核过程与剪接存在着紧密的关系,在m RNA发生剪接的过程中,会招募剪接复合体以切除内含子,连接外显子,继而招募出核转运复合体,使m RNA的剪接与出核相继顺利完成1-5。在基因的内含子被人为地删除之后,其m RNA转录产物会因为剪接事件无法顺利进行从而不能招募出核复合体,最终导致了其出核过程受阻~6。人类全部基因中含有约5%的无内含子基因,他们编码干扰素、组蛋白等众多在生命过程发挥着重要功能的蛋白~7,研究这一类天然无内含子基因m RNA转录产物的出核机制有着深远的意义。天然无内含子基因的m RNA转录产物因不具有内含子而不会发生剪接过程,在前期的研究中,本实验室通过生物信息学MEME算法对679个天然无内含子基因编码区的分析结合报告基因水平实验验证,发现天然无内含子基因中存在着具有促进出核功能的保守元件,在结合了FIMO算法进行反向检索之后,选用了出现频率最高的元件Motif1V-AS进行后续研究,其中无内含子基因KRN1的编码区含有高达9个Motif1V-AS,并且在靠近其3’端的位置存在着6个Motif1V-AS的簇状分布结构。在KRN1报告基因水平进行的预测序列整段删除及突变验证,发现天然无内含子基因KRN1编码区中存在的簇状区域作为顺式作用元件,起到了促进其m RNA转录产物完成出核转运的重要作用~8。那么,又有哪些蛋白可以与顺式作用元件相互结合而共同促进其转运出核呢?这一关键问题尚待解决。本文将对CAR-C区域的反式作用因子进行探索,从而完善天然无内含子m RNA出核转运机制。方法:1.胞外RNP组装纯化:使用体外转录技术得到含有生物素标记的CAR-C区RNA探针,将其与He La细胞核提取物共同孵育,洗脱后得到特异结合蛋白,结合质谱分析筛选出多种候选蛋白。2.出核关键蛋白筛选:在He La细胞中利用si RNA对候选蛋白进行逐个筛选,瞬时转染含有KRN1编码区序列的报告基因,荧光原位杂交技术观察其m RNA转录产物核质定位情况,以确定有促进出核作用的反式作用因子。3.免疫沉淀鉴定相互作用蛋白:构建反式作用因子过表达的稳转细胞系,免疫共沉淀技术得到与反式作用因子共同发挥作用的其他蛋白或复合体。4.探讨hn RNPR对内源性无内含子m RNA核质分布的影响:在He La细胞中使用si RNA对hn RNPR进行敲低,试剂盒核质分提,分别提取核、质RNA,送样进行RNA-seq分析,结合分析结果RT-PCR分别检测核、质中各天然无内含子基因转录产物的富集情况。结果:1.通过生物素-链酶亲和素之间相互作用得到与CAR-C区特异结合的蛋白;2.质谱分析以及si RNA筛选揭示了hn RNPR在天然无内含子基因KRN1的m RNA转录产物出核过程中起着重要的作用。荧光原位杂交实验的结果显示在敲低蛋白hn RNPR后,天然无内含子基因KRN1的m RNA转录产物被明显阻滞在了细胞核内;3.随即通过分子克隆的方法构建了带有HA标签的hn RNPR质粒并使用其构建了hn RNPR过表达稳转细胞系,将HA标签抗体加入稳转细胞系核提取物并与琼脂糖珠子共同孵育,得到与hn RNPR特异结合的一系列候选蛋白;4.结合质谱分析以及后续的si RNA筛选,在删除了候选蛋白中的核孔复合体重要组分NUP93后,天然无内含子基因KRN1的m RNA转录产物呈现了明显的核阻滞现象;5.在将已报道的31个核孔复合体组分逐个敲低后,其中十个组分（NUP107,NUP205,NUP62,NUP214,TPR,GLE1,NUP88,NUP98,Ran BP2,RAE1）的敲低会导致同样的转录产物核阻滞;6.RNA干扰结合细胞核质分提及RNA-seq分析过程中,发现在敲低了hn RNP之后,发现多种He La内源性表达的天然无内含子基因转录产物的核质分布情况均发生了不同程度的变化。结论:实验数据表明hn RNPR作为反式作用因子被天然无内含子基因中的保守元件招募,促进无内含子基因的m RNA转录产物顺利完成出核;hn RNPR与核孔复合体组分NUP93相互作用促使无内含子基因转录产物通过核孔复合体顺利完成出核转运过程;hn RNPR的敲低对于He La细胞中多种内源性表达的天然无内含子基因转录产物的核质分布均产生影响;天然无内含子基因编码区中广泛富集了促进其转录产物出核的保守元件Motif1V-AS。