HPLC-MS技术对贝类酸性多糖的检测与分析

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酸性多糖(UACPs)是贝类的重要营养成分,但目前对贝类UACPs的研究还缺乏系统性的分析和认识。本课题基于HPLC-MS技术检测分析了隶属于腹足纲和双壳纲的29种贝类的UACPs,同时分析了产地和采样时间对贝类UACPs的影响,并对其在不同组织部位的分布进行了定量检测。首先对贝类多糖提取工艺进行了优化。确定最佳工艺为依次采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解4h和3h,之后加入3倍体积无水乙醇醇沉,得到贝类粗多糖。接着采用1,9-二甲基亚甲蓝法检测贝类硫酸多糖含量。结果表明,贝类硫酸多糖含量多在1.5~2.0%范围内,砂海螂(BMA)和西施舌(BCAX)相同组织部位的硫酸多糖含量存在较大差异。然后对贝类UACPs进行定性定量检测。贝类多糖经1.3M三氟乙酸(TFA)于105℃酸水解3h后,通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化结合HPLC-MS/MS法进行分析。结果表明,糖胺聚糖类UACPs(硫酸软骨素/CS、肝素/HP、U8、U11)和非糖胺聚糖类UACPs(U6、U10)在贝类中广泛存在。在所检测的贝类中,腹足纲贝类所含的HP很少甚至没有:生活在潮间带贝类所含UACPs的种类比底栖贝类的少。层次聚类分析证实,贝类中UACPs的分布与亲缘关系具有一定的相关性。通过比较不同产地的短文蛤和泥蚶以及不同采样时间的青蛤的检测结果,发现产地和采样时间对贝类UACPs的种类和含量有一定影响。进一步分析BMA和BCAX各组织部位中UACPs的分布,发现在同种贝类不同组织部位中UACPs组成差异显著,而在不同贝类的外套、鳃和水管中UACPs也存在较大差异。之后对8种贝类的UACPs进行了结构分析。将多糖样品分别用2M和0.2M TFA溶解并在100°℃下水解1h,然后采用PMP-HPLC-MSn分析寡糖的衍生物,发现β-GlcA-(1-→2)-α-Man-(1→4)-β-GlcA-(1→2)-α-Man 四糖,进一步证实了样品中 AGSP 结构;检测到 GlcA-(1→3)-GalNAc 和 β-GlcA-(1→3)-β-GalN6S,证实了样品中 CS 结构。最后,整理汇总了本课题和实验室前期完成的48种贝类的UACPs检测数据,初步构建了贝类UACPs数据库——海产营养数据管理平台。本课题的研究结果不仅丰富了人们对贝类UACPs的认识,也为贝类营养评价提供了数据支持,对贝类UACPs资源的开发利用提供了参考依据。
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