与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene, PTEN)是迄今发现的磷酸酶家族中首个抑癌基因,PTEN蛋白具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重活性,其脂质磷酸酶活性可以去掉3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)3位上的磷酸基团,使其转化为4,5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2),从而调控细胞的增殖与凋亡。其蛋白磷酸酶活性可以抑制黏着斑激酶(FAK)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化,调节细胞的黏附及迁移。研究发现多种实体瘤中存在有PTEN基因的突变、等位基因的缺失或低表达,急性白血病(acute leukemia, AL)中也存在有PTEN基因不同程度的缺失、低表达、甲基化。但是PTEN基因及其蛋白的异常如何在AL的发生发展、血管新生及髓外浸润过程中发挥作用仍有待于进一步探讨。儿童AL是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。它是由于不成熟的淋巴系或髓系祖细胞在发育成熟过程中失去调控,从而呈克隆性扩张,使得细胞被阻滞于一定的分化期而发生的。AL的发病机制目前多认为是环境因素、遗传因素以及癌基因和抑癌基因等多种致病因素综合作用的结果。近年来由于分子生物学技术的迅速发展,多种抑癌基因在AL发病中的作用越来越明确。PTEN在AL发病机制中的作用越来月受到重视。RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术可高效、特异地下调目标基因的表达,是研究内源性基因功能和信号转导途径的强有力工具。但是在RNAi过程中常有“脱靶效应”的发生,造成对试验结果的误判。为研究PTEN基因在儿童AL发病机制中的作用,本实验构建了PTEN基因的RNAi及其逃避RNAi策略结构(RNA interference escape strategy construct,RESC)救援的慢病毒载体质粒。应用人T淋巴细胞(T Lymphocytes,T-LC)建立其阴性对照(T-LC-GFP)、PTEN基因敲减(T-LC-shPTEN)和RESC救援(T-LC-rrshPTEN)细胞模型,通过对PTEN基因的敲减及RESC救援,观察人T-LC中PTEN蛋白的表达及AKT通路的活化情况、细胞增殖和细胞周期的变化。应用人主动脉内皮细胞永生化细胞(HAEC-hT)建立其阴性对照(HAEC-hT -GFP)、PTEN基因敲减rHAEC-hT-shPTEN)和RESC救援(HAEC-hT-rrshPTEN)细胞模型,观察人HAEC-hT迁移、损伤修复变化,并检测相关信号通路分子表达情况。本实验旨在探讨PTEN基因的生物学特性,及其下游信号分子与儿童AL发生、发展的相关性。探讨所构建的RNAi及其RESC救援慢病毒载体系统在基因操作中的功能,及避免RNAi过程中脱靶效应对实验结果造成误判的作用。第一部分PTEN基因RNA干扰及其RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定实验目的：构建人PTEN基因RNAi及其RESC救援的慢病毒载体并进行鉴定,为能有效的避免“脱靶效应”所引起的假阳性结果对实验的干扰、为研究PTEN基因功能提供稳定的转染载体。方法：1.构建策略设计并合成1对已筛选确定的能表达PTEN基因RNAi的发夹式RNA结构(small or short hairpin RNA,shRNA)的单链寡核苷酸,中间添加loop环(TTCAAGAGA),每对寡核苷酸两端分别带有酶切位点以方便基因操作。该有效靶序列的特点是：GC含量在35%-55%,以碱基“G”开始,连续5个碱基“T”结束。oligo DNA经退火形成双链DNA后,将其定向克隆到载体pFLRu-GFP质粒的XbaI/XhoI酶切位点处,构建成PTEN的RNAi慢病毒载体pFLRu-U6-shPTEN。在此基础上根据密码子简并性引入RESC机制：在PTEN基因shRNA对应的位置引入4个同义点突变,在核苷酸水平上改变基因,而其所表达的PTEN天然蛋白编码不变,又使shRNA不能作用于这种“外源设计的rnRNA",从而允许救援。“外源设计的mRNA"两端分别带有酶切位点以方便基因操作。把这个基因片段与GFP报告基因融合后,定向克隆到载体pFLRu-U6-shPTEN质粒的EcoRI/BamHI酶切位点处,从而获得人PTEN基因RNAi的RESC救援慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN。把这2个载体引入RNAi实验中,如果能恢复由RNAi引起的变化,则可以排除因shRNA的脱靶效应所引起的假阳性结果,从而避免对基因功能的误判。2.PTEN基因RNAi慢病毒载体pFLRu-U6-shPTEN的构建通过3个PCR反应步骤分别扩增出：含hU6启动子(含XbaI酶切位点)的寡核苷酸片段(f1)、能使PTEN基因沉默的shRNA(含XhoI酶切位点)片段(f2)及U6-shPTEN片段(f3)。之后把f3作为插入片段,亚克隆到载体pFLRu-GFP质粒的XbaI/XhoI酶切位点。经细菌转化,氨苄抗性筛选。阳性克隆提取质粒；酶切及U6前引物测序验证。在Genbank数据库BLAST分析与其他基因的同源性。3. PTEN基因RNAi的RESC救援慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN的构建通过3个PCR反应分别扩增出对应shRNA位置有同义突变(含EcoRI酶切位点)大小为650bp的1nRNA片段(F1)、大小为560bp(含BamHI酶切位点)的mRNA片段(F2)及含有4个同义突变的PTEN基因mRNA的全长片段(F3)。之后把与报告基因GFP融合的F3亚克隆到载体pFLRu-U6-shPTEN质粒的EcoRI/BamHI酶切位点。经细菌转化、氨苄抗性筛选。阳性克隆提取质粒；酶切及测序鉴定。并与GenBank数据库中的基因进行比较。4.慢病毒的包装和滴度测定293T细胞会合度达75%时,在TRANSIT介导下,使用慢病毒包装质粒pCMV-dR8.2△R和pCMV-VSV-G的混合物(按8：1混合),分别与慢病毒质粒pFLRu-U6-shPTEN, pFLRu-U6-rrshPTEN共转染293T细胞；转染后48 h,收获上述2种慢病毒贮液。用NIH3T3细胞,采用逐孔梯度稀释法(10-1～10-6)测定病毒滴度。倒置荧光显微镜下检测GFP表达量。结果：1. pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN基因片段扩增产物经1%TAE琼脂糖凝胶电泳,紫外线透射仪下观察,在约420bp及1200bp处可见清晰条带,与RNAi实验要求的shRNA及目的基因PTEN的cDNA长度一致。2. pFLRu-U6-shPTEN经3酶切,电泳后获得预期大小的条带。证实f3片段已插入pFLRu-GFP载体中。经DNA测序鉴定pFLRu-U6-shPTEN基因序列和预期基因序列完全一致。3. pFLRu-U6-rrshPTEN经4酶切,电泳后获得预期大小的条带。证实F3片段已插入pFLRu-U6-shPTEN载体中。经DNA测序鉴定pFLRu-U6-rrshPTEN目的基因序列在氨基酸水平上与基因库的基因序列完全同源。4.用倒置荧光显微镜观察已转染的293T细胞,可见大部分包装细胞发出绿色荧光。提示PTEN基因RNAi慢病毒载体pFLRu-U6-shPTEN及其RESC救援慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN已成功构建。经过293T细胞扩增后,最终分别获得6.0×105pfu/mL、5.0×105pfμ/mL的病毒,能够满足后期的体内外实验。结论：成功构建出人PTEN基因RNAi及其RESC慢病毒载体。为研究PTEN基因的功能提供了稳定的转染细胞载体。第二部分PTEN基因敲减及RESC救援后T淋巴细胞增殖和信号通路的变化实验目的应用已成功构建的人PTEN基因RNAi慢病毒载体及其RESC救援慢病毒载体感染人类正常T淋巴细胞(T-LC),建立PTEN基因敲减及其RESC救援的细胞模型；观察PTEN基因敲减前后及RESC救援后人T-LC信号通路、细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化,为进一步研究淋巴细胞性白血病的发病机制提供基础。方法1.T-LC培养及纯化健康人外周血由健康志愿者提供(所有志愿者均签署知情同意书)。先制备外周血单个核细胞(PMNC),再用免疫磁珠法纯化出T-LC。应用含10%FBS的RPMI1640培养基培养。2.PTEN基因敲减及其RESC救援T-LC细胞模型的建立用pFLRu-GFP质粒、shPTEN和rrshPTEN转染T-LC,建立T-LC的阴性对照模型(T-LC-GFP)、PTEN基因敲减模型(T-LC-shPTEN)及其RESC救援模型(T-LC-rrshPTEN)等细胞模型。3. Western blot检测PTEN和pAKT蛋白的表达收获、裂解细胞获取总蛋白,取各组等量蛋白于聚丙烯酰胺凝胶中电泳,用PVDF膜转膜、封膜、再加入PTEN、pAKT、AKT和β-actin抗体孵育、二抗孵育、化学发光、摄片。应用ImageJ公共图像处理软件对Western blot结果进行量化分析。4.MTT法检测PTEN基因敲减及RESC救援对T-LC生长的影响取T-LCT-LC-GFP、T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN等4组的对数期细胞,细胞浓度为1×106/mL时,按200μL/孔接种于96孔板中,每组设3个复孔,在培养第1、2、3、4、5 d时,分别取出一板,加MTT溶液后继续培养4 h,酶标仪上测定各孔OD 570nm值。5.流式细胞术检测PTEN敲减及RESC救援对细胞周期及凋亡的影响将T-LC、T-LC-GFP、T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN等4组细胞调整到5×105/50μL, 10mg/mL RNaseA 20μL,37℃作用30 min,加入碘化丙锭(PI)用流式细胞仪检测细胞周期。Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率6.统计学分析应用SSPS 13.0统计软件进行数据统计分析,数据用均数±标准差(X+s)表示,采用方差分析及q检验,a=0.05为检验水准。结果1.用慢病毒载体pFLRu-GFP、pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN感染染T-LC后,用倒置荧光显微镜观察GFP表达情况,可见大部分T-LC在荧光激发下发出绿色荧光,提示T-LC-GFP、T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN等细胞模型构建成功。2. Western blot方法显示：T-LC-GFP组PTEN基因的表达与T-LC组相比无明显变化(P>0.05),T-LC-shPTEN组PTEN基因表达较T-LC组、T-LC-GFP组减弱(P<0.01), T-LC-rrshPTEN组,PTEN基因(与GFP基因一起)又出现了表达,与T-LC-GFP组、T-LC-shPTEN组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。T-LC细胞的阴性对照、PTEN基因敲减模型及RESC救援细胞模型T-LC-GFP、T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN构建成功。3. Western blot检测pAKT蛋白的表达：与T-LC组和T-LC-GFP组细胞比较,T-LC-shPTEN组细胞pAKT的表达明显增多(P<0.01),而T-LC-rrshPTEN组细胞的pAKT则与前两者相似(P>0.05),表明PTEN敲减后激活了T-LC中的PI3K/AKT信号通路,而RESC救援则又使PTEN基因敲减所引起的pAKT表达恢复到敲减之前的状态。4.MTT法测量细胞生长曲线显示：T-LC-shPTEN组细胞生长增快,与T-LC组和阴性对照细胞T-LC-GFP组相比,于第2天开始即有明显差异(P<0.05)。而T-LC-rrshPTEN组细胞生长速度与T-LC组和T-LC-GFP组相似(P>0.05),提示RESC救援能恢复PTEN基因抑制细胞生长的功能。5.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化显示：PTEN基因敲减后(T-LC-shPTEN组)G0/G1期细胞明显减少,S期细胞明显增加,G2/M期细胞增加,细胞凋亡减少。与其他3组细胞相比,差别均有统计学意义(P<0.01)。RESC救援后(T-LC-rrshPTEN组),G0/G1期细胞、S期细胞和G2/M期细胞及细胞凋亡情况又分别恢复。与T-LC组和T-LC-GFP组相比,差别无统计学意义(P>0.05)。结论1.PTEN基因敲减后,T淋巴细胞在增殖能力、细胞周期、细胞凋亡、信号传导通路等方面的生物学特性都有改变,PTEN基因在分子水平参与了儿童AL的发病机制。2.RESC救援慢病毒载体仅在核苷酸水平上改变基因,其所表达的PTEN天然蛋白编码不变,实现真正意义的救援,避免了RNAi过程中脱靶效应副作用对实验造成的影响,弥补了同类研究的遗漏与不足。第三部分SIP、VEGF作用下PTEN基因敲减后内皮细胞损伤修复的变化实验目的应用已成功构建的人PTEN基因RNAi及其RESC救援慢病毒载体感染人主动脉内皮细胞的永生化细胞(HAEC-hT),建立其阴性对照(HAEC-hT-GFP)、PTEN基因敲减(HAEC-hT-shPTEN)和RESC救援(HAEC-hT-rrshPTEN)细胞模型,观察人HAEC-hT迁移、损伤修复变化,并检测相关信号通路分子表达情况。方法1.HAEC永生化及验证HAEC购自Clonetics公司,由美国圣路易斯华盛顿大学医学院血液学实验中心Mr. Longmore实验室进行永生化(命名为HAEC-hT)处理并验证后,用EGM完全培养基传代培养。2.PTEN基因敲减及其RESC救援HAEC-hT细胞模型的建立用pFLRu-GFP质粒、pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN转染HAEC-hT,建立HAEC-hT的阴性对照模型(HAEC-hT-GFP)、PTEN基因敲减模型(HAEC-hT-shPTEN)和PTEN基因RESC救援模型(HAEC-hT-rrshPTEN)等细胞模型。3. PTEN敲减及其RESC救援后HAEC-hT单个细胞迁移分析观察在整个过程中未分裂、未与其他细胞接触、未迁移到视野外的细胞,用Olympus X81倒置显微镜每4 min拍照1次,连续12 h。ImageJ软件追踪每个细胞的运动路径。比较4组及加入S1P、VEGF刺激后细胞不同时间迁移方向与速度。4.PTEN敲减及其RESC救援后HAEC-hT细胞创伤愈合试验分析各组细胞乏血清培养2 h后,制作大约230±32μm宽伤口(约移除49±7%的培养细胞)。用Olympus X71定时显微镜(10×)每隔5 min拍照创伤愈合情况。创伤愈合率用ImageJ做定量分析。5. Western blot检测pAKT蛋白的表达取PTEN敲减及其RESC救援后HAEC-hT细胞乏血清培养2 h,随后进行损伤,加或不加1μM/mL的S1P、50ng/mL的VEGF,分别在0、15、30min时间点收获细胞,用Western blot检测pAKT蛋白的表达。结果：1.永生化的血管内皮细胞形态和生长速度同原代培养细胞无差异,两者对S1P、VEGF刺激具有相同反应。2.2个对照组细胞形态均为梭形,细胞核具有明显的两极,细胞迁移是细胞板状突起伸展、收缩引起外形不断变化,但朝向一极运动。PTEN敲减后的内皮细胞体积变大,细胞形态趋向圆形,胞核形态改变不明显。细胞运动速度增快(P<0.05),而且运动明显缺乏方向性。RESC救援后的细胞不论从形态,还是运动速度及运动的极向性均和对照组细胞无明显差异(P>0.05)。3. S1P、VEGF能够明显促进内皮细胞的迁移及损伤修复(P<0.05)。但在PTEN敲减细胞中,S1P、VEGF刺激仅使得损伤修复速度少量增加(P>0.05)。4.添加S1P、VEGF刺激后,对照组细胞中pAKT表达量随着时间的延长均有所增加(P<0.05)。PTEN敲减组3个时间点pAKT表达量无明显差异(P>0.05),但与对照组相比其表达量增加。在伤口修复过程中,S1P、VEGF的加入增加了pAKT蛋白的活性。RESCU救援后pAKT表达量与对照组相似。结论：1.PTEN的缺失使血管内皮细胞失去极性运动的能力；由于缺乏趋向损伤部位方向性的运动,从而影响内皮细胞对损伤的修复。2. SIP、VEGF能够通过激活PI3K/AKT信号通路而明显促进内皮细胞的迁移及损伤修复。PTEN基因敲减后,SIP、VEGF的加入使内皮细胞的损伤修复速度减慢。