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研究目的:1.观察大黄素在病毒性心肌炎(VMC)小鼠中的疗效;2.观察大黄素调控TLR介导的心肌病理损伤的炎症应答作用;3.建立CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎模型,探讨大黄素调控病毒感染引起心肌炎症免疫应答的相关分子机制;4.优化VMC的治疗策略,开拓大黄素的临床应用价值。研究方法:选择90只雄性4—6周龄的BALB/c小鼠,体重均在14—16g之间,按照随机数字表法随机将小鼠分为三组,分别是A组:对照组,B组:模型组,C组:大黄素组,每组30只小鼠。A组:小鼠给予腹腔注射0.1ml不含病毒液的培养液。B组:小鼠腹腔注射0.1ml内含1×102TCID50柯萨奇病毒B3的Eagle’ s液建立VMC模型,C组:建立VMC模型基础上,大黄素灌胃给药30mg/kg/d,1次/d,连续给药14d;A、B组小鼠给予喂饲等量的蒸馏水,观察小鼠的生存情况,记录实验期间小鼠死亡数目。于实验开始后第7d每组处死5只小鼠,取出心脏测定病毒滴度,将心脏剪碎后研磨,离心取上清液,稀释成不同的浓度,取各种浓度(10-10-2,10-3 10-4 10-5,1-6)的稀释液0.2ml,加入96孔板(Hela细胞),设置4个复孔,观察细胞情况,病变孔:病变细胞>50%,依据Reed-Muench法测定,采用lgTCID50。荧光定量PCR测定CVB3mRNA拷贝数:提取心肌组织中病毒的总RNA,紫外分光光度法测定D260/D280比值(1.8—2.0),扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,重复测定3次,以相对表达量表示。然后分别在第7天、第14天每组抽取小鼠8只,处死解剖,取出心脏,经固定、水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、石蜡切片制作、封片、HE染色等步骤制作小鼠心肌病理切片。HE染色观察心肌病理形态学变化,并进行病理积分的计算。方法如下:做好的切片每一张均随机选取5个高倍镜视野,在高倍镜视野下观察并计算视野内坏死区域的面积以及炎性细胞的浸润面积所占整个视野面积的比值。0分:无病变;1分:病变面积<25%;2分:病变面积25%—50%;3分:病变面积51%—75%;4分:病变面积>75%。RT-PCR测定心肌组织TLR4 mRNA,首先把心肌组织总的RNA提取出来,然后再将总RNA逆转录成cDNA。RT-PCR依据Trizol法操作,定量采用紫外分光光度计,将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,重复测定3次,以相对表达量表示:基因灰度值与β-actin灰度值比值。Western-blot法测定心肌炎症因子、TLR4-NF-kB、P38MAPK表达,ELISA检测血清水平炎症因子变化。并进行乳鼠心肌细胞的原代培养,取1天龄的新生乳鼠60只,均采取牵拉脊柱法处死,然后固定在泡沫板上;沿小鼠的左肋下缘逐渐将胸腔剪切开,充分暴露胸腔并找到心脏,用剪刀剪断大血管和周围组织,再用镊子将心脏轻轻取出,把心室部分的心脏组织完全剪碎,用不含血清的培养液洗1～2遍之后,转移入50ml离心管中;经胰酶反复消化6次,取沉淀物重悬并在培养瓶中进行培养,培养后再进行传代与冻存。经原代培养新生乳鼠的心肌细胞随机分为了4组,分别是A组:对照组,B组:模型组,C组:大黄素组,D组:LPS+大黄素组。其中,A组不给予病毒液。B组:应用CVB3感染心肌细胞8h。C组:用大黄素100ug/ml预处理心肌细胞2h,再应用CVB3感染心肌细胞8h。D组:预先LPS激活心肌细胞病毒8h,再用大黄素l00ug/ml进行阻断2h。检测TLR4、NF-kB及其下游关键因子IkB a及p65的蛋白水平变化。通过Western-blot法测定炎症因子、TLR4-NF-kB与相关分子如p-IkBα、p-p65的表达及TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1等因子的浓度。结果:1.与对照组比较,模型组心肌病理积分、心肌组织P38MAPK、TLR4mRNA表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,大黄素组死亡率、病毒滴度、CVB3mRNA拷贝数、心肌病理积分显著降低(P<0.05),心肌组织P38MAPK、TLR4mRNA表达明显下调(P<0.05)。2.TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的血清浓度在模型组较对照组显著升高,两者有显著的统计学差异(P<0.05);而使用大黄素干预后,大黄素组小鼠血清浓度较模型组有明显的降低,并且比较有统计学差异(P<0.05)。3.TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的蛋白水平在模型组较对照组显著升高,两者有显著的统计学差异(P<0.05);而使用大黄素干预后,大黄素组小鼠的蛋白水平较模型组有明显的降低,并且比较有统计学差异(P<0.05)。4.心肌细胞原代培养,使用病毒感染细胞组别中TLR4、NF-kB蛋白表达显著升高,IkB α及p65的磷酸化水平也有明显上调;而使用大黄素预处理组别中,这些蛋白水平有了明显的下调,差异有统计学意义(P<0.05)。5.使用TLR4激动剂LPS对细胞进行处理,发现在LPS+Emodin组,其炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的浓度水平与模型组无统计学差异(P>0.05),而与大黄素组比较,则有明显的升高。结论及意义:1.在VMC的发病进程中,TLR4—NF-κB和TLR4—P38MAPK信号传导途径起关键性作用。2.在VMC的发病进程中,炎症反应始终存在,诸多免疫炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1等发挥了重要作用。3.大黄素有治疗小鼠病毒性心肌炎的作用,其分子机制:(1)大黄素通过下调TLR4、P38MAPK水平来起到保护CVB3感染小鼠心肌的作用;(2)大黄素能够很好的阻断VMC疾病进程中的炎症过程;(3)大黄素能够通过阻滞TLR4-NF-kB信号通路的活化来减少炎症因子和炎性细胞的浸润,从而减轻心肌组织损伤,使疾病得到缓解与改善。