研究背景子宫内膜癌是我国女性生殖系统恶性肿瘤中发病率居第二位的疾病。据据国家癌症中心统计,2015年我国子宫内膜癌的发病人数为6.34万,死亡2.18万[1]。根据病因子宫内膜癌可分为两型。其中Ⅰ型为雌激素依赖型的高、中分化子宫内膜样癌,多由子宫内膜的良性病变和不典型增生恶变而来,约占子宫内膜癌的80%,预后良好。Ⅱ型为非雌激素依赖型,又称不良组织学类型的子宫内膜癌。主要包括组织学上非子宫内膜样的子宫内膜浆液性癌、透明细胞癌、癌肉瘤、未分化癌等,低分化的子宫内膜样癌也包括在其中。这类肿瘤的前驱病变不明,通常为低分化,约占子宫内膜癌的10-20%,预后不良[2]。大多数子宫内膜癌患者在诊断时处于临床早期,约有68%的病变局限于原发部位,20%有局部或淋巴结的播散,8%发生远处转移[3]。据统计,FIGO分期Ⅰ期的患者五年生存率为80-90%,Ⅱ期为70-80%,ⅢC-Ⅳ期的晚期患者仅为20%左右。子宫内膜癌标准的治疗方法为包括全子宫+双侧附件切除术在内的全面分期术,针对有预后高危因素的患者,术后辅助放疗或化疗。如何改善晚期患者的预后是目前子宫内膜癌治疗的难点[3]。近年来肿瘤免疫治疗发展迅速,2013年癌症免疫疗法被科学杂志评为全球十大突破之首,Nature和Science相继推出肿瘤免疫治疗专刊。子宫内膜癌对免疫靶向治疗显现出良好的治疗反应,对相关靶向生物标记物的探索成为热点研究领域[4]。宿主的免疫系统是机体抗肿瘤免疫治疗中的主要场所,肿瘤免疫细胞聚集以抵御肿瘤是肿瘤基因发生学的重要一环[5]。肿瘤细胞和免疫细胞的协同作用构成了肿瘤微环境（TME）,控制着肿瘤的发生、局部侵袭和转移。一方面,机体通过正常的免疫系统识别并杀伤肿瘤细胞,另一方面肿瘤细胞通过多种手段来逃避机体的免疫监视作用,形成免疫抑制。同时,免疫系统还为肿瘤提供了炎症发生和进展转移的微环境[6-8]。基于上述机制,很多免疫治疗的策略着眼于抗肿瘤免疫反应,T细胞介导的细胞免疫则是抗肿瘤的主要免疫应答方式。抗PD-1和抗PD-L1作为免疫检查点抑制剂,阻止肿瘤上的PD-L1与效应T细胞的PD-1结合,从而解除了肿瘤细胞对T细胞的抑制作用,上调T细胞的杀伤功能[9-11]。临床试验的结果表明,帕博利珠单抗（抗PD-1）单药用于治疗MSI-H和dMMR的晚期或复发的子宫内膜癌,其响应率高达57%,昭示了晚期子宫内膜癌生存率改善的曙光[12]。异位淋巴组织（Ectopic lymphoid tissue）,又称为三级淋巴结构（Tertiary lymphoid structures,TLS）,是在非淋巴组织中伴随着慢性炎症反应形成的异位淋巴器官,主要由B淋巴细胞组成[13]。其典型的结构特征为在炎性组织中存在大量聚集的CD20表达阳性的B淋巴细胞团[14]。研究发现,这一结构也存在于多种实体肿瘤,如乳腺癌、肺癌和结直肠癌等组织中,并且与预后获益相关,从而在肿瘤领域引起了广泛关注[15-17]。在肿瘤微环境中,TLS能够独立于二级淋巴器官（SLO）而触发免疫应答[18]。TLS的上调可能引起显著的抗肿瘤反应,研究发现这可能与B细胞及相关通路有关。B细胞作为体液免疫应答的重要组成部分,负责产生和释放特定抗原的抗体,参与了抗体介导的免疫反应。TLS作为肿瘤组织中大量B细胞的富集区域,通过B细胞或其它肿瘤浸润免疫细胞引发炎症反应,触发下游通路的有效位点,进而发挥有效的抗肿瘤生物效应[19,20]。目前在妇科肿瘤领域关于TLS的研究仅卵巢癌有文献提及[21],在子宫内膜癌中尚未见到相关报道。TLS作为B细胞通路的有效作用位点,其相关分子通路具有一定的生物标记功能,有可能在肿瘤免疫靶向治疗领域引发新的突破。本研究分别利用北京协和医院和日本京都大学的子宫内膜癌患者数据库,观察了TLS在子宫内膜癌中的表达,通过免疫组化、免疫荧光等方法对TLS结构进行探讨与验证。进一步采用高通量测序、RNA-seq等技术对相关分子通路进行了探索,同时研究了与子宫内膜癌分子分型的关系。研究方法1、TLS在子宫内膜癌中的构成及其与预后关系的研究回顾性收集2006年至2011年日本京都大学附属医院妇产科子宫内膜癌患者临床数据,对入组患者进行标本取材及制备切片,通过HE染色及免疫组化方法,确定TLS结构在肿瘤组织中的表达情况及镜下结构,并对TLS与子宫内膜癌患者的预后关系进行初步探索。2、TLS在子宫内膜癌中的表达验证及相关蛋白通路的探讨（1）回顾性收集2010年至2014年在北京协和医院妇产科单一手术团队所有经活检病理确诊且进行子宫切除手术的子宫内膜癌患者的临床信息及病理特点。患者排除标准包括:1)接受新辅助化疗;2)子宫切除术后病理无肿瘤组织;3)留存石蜡固定组织不充分,切片不清晰,无法完成镜下评估;4)缺少必要的临床信息。观察HE染色切片及制备相应切片,通过免疫组化方法,进一步对CD20阳性细胞表达情况以及TLS结构的表达进行验证。（2）通过免疫荧光方法,对TLS相关的B细胞通路分子CXCL13/CXCR5表达进行探索,观察其分布及定位情况。（3）采用单因素及多因素统计分析方法对TLS与子宫内膜癌患者的预后进行探索。3、TLS在子宫内膜癌中的分子通路研究及生物信息学分析（1）收集10例2020年11月至2021年2月于北京协和医院妇产科单一手术团队手术治疗的子宫内膜癌患者的新鲜肿瘤病理标本,通过DNA panel测序及RNA-seq测序,对TLS组与无TLS组进行差异基因表达分析。进一步进行GO及KEGG分析,探索其下游富集通路,通过GSVA分析技术对肿瘤免疫环境进行探讨。同时进一步探索了 TLS与TCGA分子分型的关系。（2）利用TCGA子宫内膜癌数据库,对子宫内膜癌组织中TLS相关基因进行筛选,分析基因表达差异及其与预后的关系。研究结果1、TLS在子宫内膜癌中的构成及其与预后关系的研究（1）本章研究入组了 104例京都大学附属医院妇产科子宫内膜癌患者作为实验组,10例正常子宫内膜组织和10例AEH组织作为对照组。通过镜下观察HE染色及CD20免疫组化切片,证实成团聚集的CD20淋巴细胞阳性表达于子宫内膜癌肿瘤组织中,而在对照组中基本不表达。这表明子宫内膜癌组织中存在TLS,在对照组中不存在。（2）TLS由大量CD20+B细胞聚集团块及少量CD8+T细胞、CD4+T细胞、浆细胞构成,有或无CD23+生发中心（GC）。TLS根据镜下形态结构可分为聚集型TLS和分散型TLS。TLS根据位置可分为浸润于肿瘤细胞内部间质和肿瘤细胞边缘间质。TLS根据CD23+GC表达分为成熟阶段TLS（含有阳性CD23+GC）和幼稚阶段TLS（无CD23+GC）。（3）在104例入组子宫内膜癌患者中,含有TLS者为81例（77.9%）,无TLS患者为23例（22.1%）。含有TLS的子宫内膜癌患者PFS优于无TLS患者（P<0.001）,不论病理分化程度。多因素分析结果显示,TLS的缺失是子宫内膜癌患者复发的独立风险预测因子（HR=0.154,95%CI 0.044-0.536,P=0.003）。2、TLS在子宫内膜癌中的表达验证及相关蛋白通路的探讨（1）本章入组了 93例北京协和医院妇产科单一手术团队的子宫内膜癌患者。通过对HE染色及免疫组化染色镜下观察,发现成团聚集的CD20阳性表达B淋巴细胞广泛存在于子宫内膜癌组织中。这同样表明TLS存在于子宫内膜癌中,形态及成熟度与前期研究相似。（2）进一步验证TLS中CD20+B细胞与其他淋巴浸润细胞（TIL）的关系,及不同TIL与预后的关系。结果表明子宫内膜癌中TLS的表达显著增加了肿瘤组织中CD20+B细胞数量（P<0.001）。CD20+B细胞数量与CD8+T淋巴细胞（P<0.001,r=0.357）、CD4+辅助T淋巴细胞（P<0.001,r=0.48）数量呈正相关。高表达的CD20+B细胞和CD8+T细胞与子宫内膜癌较好的PFS相关（P=0.028）。（3）CXCR5作为CXCL13的表达受体,二者表达存在正相关性（r=0.344,P<0.001）。CXCL13/CXCR5轴作为B细胞通路相关分子,在TLS中特异性表达（P<0.001）。（4）在93例入组子宫内膜癌患者中,35例（37.6%）有TLS,58例（62.4%）无TLS。含有TLS的子宫内膜癌患者的PFS（P=0.032）及OS（P=0.046）均明显优于无TLS患者。多因素分析结果显示,TLS的缺失是子宫内膜癌患者复发的独立风险预测因子（HR=0.125,95%CI 0.024-0.667,P=0.015）。（5）进一步分析北京协和医院和京都大学附属医院子宫内膜癌患者中TLS表达率存在差异性的原因。通过进行两组患者临床病理特点的比较,发现TLS表达率的差异性与国内外患者的不均质性相关。此外所用CD20抗体试剂及免疫组化实验环境的不同,对抗体表达强弱都产生了一定影响。此外肿瘤组织的人种和基因差异,也可能造成了 CD20表达率的不同。3、TLS在子宫内膜癌中的分子通路研究及生物信息学分析（1）本章研究入组了 10例子宫内膜癌病人的新鲜肿瘤病理标本。入组10例患者中,6例（60%）TLS阳性表达,4例（40%）TLS阴性表达（2）TLS表达在不同分子分型的子宫内膜癌中具有差异性（P=0.019）。2例POLE超突变型、1例MSI-H型和3例高拷贝型内膜癌患者均有TLS,而4例低拷贝型患者均无TLS。其中一例POLE超突变患者TLS表达量高度阳性。（3）对TLS组及无TLS组进行差异基因表达分析,TLS组相比无TLS组表达上调的基因包含:CCDC106、KRT128P等。TLS组相比无TLS组表达下调的基因包含:LAMP5-AS1、ANKRD34C、OAT等。该部分差异基因表达可能与组蛋白HE-K9甲基化代谢通路相关。（4）进一步通过GSVA分析对肿瘤免疫微环境进行比较,结果显示TLS肿瘤组织较无TLS肿瘤组织富含更多活化B淋巴细胞、活化CD4+T细胞、活化CD8+T细胞、Tfh细胞及其他不同类型的B细胞和T细胞。这与上一章免疫组化的实验结果是相一致,同时表明包含TLS结构的肿瘤组织中肿瘤免疫微环境更成熟活跃。（5）基于生物信息数据库对子宫内膜癌基因数据进行挖掘,T淋巴细胞（CD8、CTLA4、FOXP3、TCF7）、B淋巴细胞（CD23）、浆细胞、趋化因子家族基因等相关通路分子可能均与子宫内膜癌患者预后表达差异存在相关性。研究结论1、本课题分别利用北京协和医院和京都大学附属医院的子宫内膜癌患者肿瘤数据库,首次证实了 CD20+B淋巴细胞成团聚集于子宫内膜癌肿瘤组织中,并形成了 TLS结构。TLS存在于子宫内膜癌组织中,表达率约40-70%。TLS表达率的差异性与患者的不均质性及CD20抗体试剂等因素有关。2、TLS由大量CD20+B细胞聚集团块及少量CD8+T细胞、CD4+T细胞、浆细胞构成,有或无CD23+生发中心。TLS根据镜下形态结构可分为聚集型TLS和分散型TLS。TLS根据位置可分为浸润于肿瘤细胞内部间质和肿瘤细胞边缘间质。TLS根据CD23+GC表达分为成熟阶段TLS（有阳性CD23+GC）和幼稚阶段TLS（无阳性CD23+GC）。这与文献中报道的其他实体瘤存在的TLS一致。子宫内膜癌中TLS的表达显著增加了肿瘤组织中CD20+B细胞数量。CD20+B细胞数量与其他肿瘤浸润细胞数量呈正相关。CXCL13/CXCR5轴作为B细胞通路相关分子,在TLS中特异性表达。3、含有TLS的子宫内膜癌患者PFS优于无TLS患者,不论病理分化程度。两种多因素分析结果均表明,TLS的缺失是子宫内膜癌患者复发的独立风险预测因子。4、TLS组相比非TLS表达上调的基因包含:CCDC106、KRT128P等。TLS组相比非TLS表达下调的基因包含:LAMP5-AS1、ANKRD34C、OAT等。该部分差异基因表达可能与组蛋白HE-K9甲基化代谢通路相关。包含TLS结构的肿瘤组织中肿瘤免疫微环境更成熟活跃。TLS表达在不同TCGA分子分型的子宫内膜癌中具有差异性。POLE超突变患者TLS表达量高。基于生物信息数据库对子宫内膜癌基因数据进行挖掘,对前期免疫组化实验进行了进一步验证。TLS及相关B细胞通路分子作为潜在的生物标记物,如何诱导TLS形成以抑制肿瘤发生将成为未来的研究方向,这对肿瘤靶向治疗具有一定探索意义。