【摘 要】
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链霉菌SH-62是我校周啟教授从湖北房县分离得到的一株具有较好生物活性的链霉菌。前期研究发现该链霉菌基因组中含有丰富的天然产物生物合成基因簇,绝大多数都是未知功能,具有发掘新型天然产物合成基因的潜力。首先我们对链霉菌SH-62的接合转移条件进行了优化,寻找到最合适的供体宿主菌、预萌发时间和接合转移培养基,提高了链霉菌SH-62接合转移的效率,为后期基因中断、基因缺失等遗传操作奠定了基础。通过生物信
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链霉菌SH-62是我校周啟教授从湖北房县分离得到的一株具有较好生物活性的链霉菌。前期研究发现该链霉菌基因组中含有丰富的天然产物生物合成基因簇,绝大多数都是未知功能,具有发掘新型天然产物合成基因的潜力。首先我们对链霉菌SH-62的接合转移条件进行了优化,寻找到最合适的供体宿主菌、预萌发时间和接合转移培养基,提高了链霉菌SH-62接合转移的效率,为后期基因中断、基因缺失等遗传操作奠定了基础。通过生物信息学分析,我们在链霉菌SH-62的基因组中发现至少有37个次级代谢产物的生物合成基因簇,其中18个基因簇为PKS和/或NRPS基因簇。依据18个PKS/NRPS基因簇的序列,设计相应的特异性引物,通过PCR的方法对链霉菌SH-62基因组BAC文库进行筛选,共获得178个阳性克隆子。利用序列分析对这些阳性克隆子进行了分类及重叠性排列,选取其中110个BAC克隆进行异源表达实验。将这些BAC质粒通过属间接合转移分别导入变铅青链霉菌、白色链霉菌和链霉菌Streptomyces sahachiroi中,在不同的发酵条件下进行异源表达实验,利用生物活性测定和薄层层析（TLC）分析对发酵产物进行检测。在异源表达菌株的筛选中,我们发现了3个可能异源表达成功的基因簇。其中一个I型PKS和格尔德霉素生物合成基因簇高度同源。我们在该基因簇的异源表达产物中初步分离到两个化合物,然而它们是否由该基因簇催化合成还需要进一步实验验证。另一个I型PKS基因簇与已知的天然产物生物合成基因簇相似性不高,推测可能是一个新型天然产物合成基因簇。HPLC分析初步确定了其异源表达产物可能的特征吸收峰。第三个基因簇是一个杂合的PKS-NRPS基因簇（lem）,与雷纳霉素生物合成基因簇（lnm）具有相似性。预测其合成产物可能为一种新的大环内酰胺类抗生素,与雷纳霉素具有相似的结构。将包含有完整lem基因簇的BAC质粒导入链霉菌S.sahachiroiΔazi B和S.avermitilis中异源表达产生微弱的抑菌活性。通过RT-PCR和关键基因的敲除实验,我们初步证实抑菌活性物质是由该基因簇异源表达产生,异源表达产物的结构还有待进一步的分析。
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