研究背景乳腺癌是危害妇女健康的最主要恶性肿瘤之一，据统计每年全球范围内大约有120万妇女罹患乳腺癌，超过50万人死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家和地区，乳腺癌的发病率已占女性恶性肿瘤首位；在我国，虽乳腺癌发病率较低，但近些年来有明显上升趋势，并呈现出年轻化的趋势。乳腺癌是一种激素诱发的肿瘤，根据这个特点进行内分泌治疗已有100多年的历史。选择将雌激素受体（estrogen receptor，ER）作为乳腺癌病人预后评估因子以及治疗靶点有着重要的临床意义，肿瘤活检检测ER已经成为选择治疗方案的常规检测手段。目前，对ER阳性乳腺癌的第一线疗法是雌激素受体拮抗剂，如他莫昔芬等药物。但约有30%的患者在接受他莫昔芬类药物内分泌治疗后并没有取得明显的治疗效果,会出现原发或者继发性耐药现象，其抗药耐药原因目前不是很明确,近年来对其耐药机制的研究也成为此方面学者研究的热点。在继发现了第一个雌激素受体ERα后约10年，1996年成功地克隆及鉴定了第二个雌激素受体ERβ。从而ERβ的检测，在乳腺癌中的潜在应用价值及在乳腺癌的发生、发展、预后评估和内分泌治疗效果评估等方面的研究日益受到重视。但是目前，临床实验室采用免疫组织化学法检测乳腺癌的ER表达水平时，使用的抗体大多只针对ERα或不能有效的区分ERα和ERβ。国内外研究界关于ERβ在乳腺癌患者他莫昔芬耐药中的作用研究非常少，而且各实验小组的研究结果差异很大，甚至结论截然相反；能否将ERβ作为评估乳腺癌内分泌治疗预后的一个指标，也尚无定论。本课题旨在通过使用更加灵敏、高效的方法改变乳腺癌细胞系本身的ERβ水平，进而在此基础上通过一系列实验技术观察细胞对他莫昔芬的反应性，以明确ERβ水平在他莫昔芬内分泌治疗耐药中可能的作用，并试图阐明其可能分子机制，进而为临床更合理、有效应用雌激素受体拮抗剂等内分泌药物治疗乳腺癌提供直接的、有价值的参考资料。实验目的本实验旨在通过使用更加灵敏、高效的方法改变乳腺癌细胞系本身的ERβ水平，进而在此基础上通过一系列实验技术观察这些细胞对他莫昔芬的反应性；以明确ERβ水平在他莫昔芬内分泌治疗耐药中可能的作用，并试图阐明其可能的分子机制，进而为临床更合理、有效应用雌激素受体拮抗剂等内分泌药物治疗乳腺癌提供直接的、有价值的参考资料。实验方法1.构建含人ERβ基因的重组慢病毒表达载体利用RT-PCR技术成功扩增克隆出人ERβ基因片段，然后利用一种克隆操作平台Gateway技术，将目的基因连接到入门载体pENTRTM3C，再经LR重组反应转入到pLenti6.3/V5-DEST载体中，经鉴定从而成功构建含人雌激素受体ERβ基因的重组慢病毒表达载体pLenti-ERβ；自Sigma公司直接选购能有效沉默ERβ基因的慢病毒短发夹状RNA（pLKO-shRNA），其沉默ERβ基因有效性均已经得到验证。2．将上述构建载体ERβ pLKO-shRNA，通过包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G和干涉质粒三质粒体系包装慢病毒，所得病毒液感染乳腺癌细胞株T47D和MCF-7；瞬转48h，常规提取对应总RNA和蛋白经过PCR、western-blot鉴定，分别初筛选出对ERβ基因干涉效果明显的靶点（每株细胞选出两个靶点）并加一定浓度嘌呤霉素（puromycin1mg/L）连续加压筛选4W；待细胞不再死亡(此时空白对照con组细胞已完全杀死)，表明阳性克隆已形成。并再次分别从mRNA水平和蛋白水平验证ERβ基因表达量。建立稳定下调ERβ基因水平乳腺癌稳转细胞株T47D和MCF-7。3．以所构建稳定下调ERβ基因的两乳腺癌细胞株作为研究对象，分别从细胞增殖和凋亡等方面，观察乳腺癌细胞生物学特征及对他莫昔芬反应性的变化。涉及实验方法有：MTT法（3-(4,5dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，四甲基偶氮唑蓝）、EdU法（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，5-乙炔基-2，脱氧尿嘧啶核苷）、FCM（流式细胞技术）以及TUNEL法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TdT介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法）等，在此基础上，着重利用western-blot(蛋白免疫印迹)法从细胞凋亡相关分子入手，探究下调ERβ基因水平引起乳腺癌细胞对他莫昔芬反应性改变的可能分子机制。实验结果1．构建含人ERβ基因的重组慢病毒表达载体所构建载体经琼脂糖凝胶电泳、PCR和基因测序鉴定结果显示，已成功构建含人ERβ基因的重组慢病毒表达载体（pLenti-ERβ）；针对靶向下调ERβ基因的pLKO-shRNA慢病毒表达载体的有效性已由所购公司验证。2．成功建立稳定下调ERβ基因水平乳腺癌稳转细胞株T47D和MCF-7首先成功初筛选出干涉效果最明显两个靶点，即T47D细胞（pLKO-shRNA-3326/3327）和MCF-7细胞（pLKO-shRNA-3325/3326），并以此作后续实验：加一定浓度嘌呤霉素连续加压筛选4W后，mRNA水平和蛋白水平验证ERβ表达量，RT-PCR结果显示：与对照组相比，实验组ERβ mRNA的表达明显降低，两细胞实验组ERβ mRNA下调率分别达(61.12±3.66)%、(76.47±3.16)%（T47D）和(62.42±0.07)%、(42.49±1.96)%(MCF-7)；western-blot法检测两乳腺癌细胞株ERβ蛋白表达水平：所得两细胞株各自对照组(con、scr)、实验组(T47D-ERβ-s1/s2和MCF-7-ERβ-s1/s2) ERβ蛋白表达，经软件图像分析，与对照组相比，实验组ERβ蛋白表达量均有明显降低：其中T47D-ERβ-s1、s2两组蛋白量分别下调率为(60.83±3.07)%和(53.31±3.00)%；MCF-7-ERβ-s1、s2两组下调率达(83.69±5.07)%和(73.16±13.21)%。而阴性对照组与空白对照组相比，ERβ蛋白表达无明显变化。以上结果均为3次测量结果。3.稳定下调ERβ基因水平的两株乳腺癌细胞株为基础，分别从细胞增殖、凋亡等方面检测在下调ERβ水平对乳腺癌细胞生物学特征、细胞对他莫昔芬反应性的影响：①MTT法检测下调ERβ水平对乳腺癌细胞增殖及对TAM反应性影响两株细胞系scramble、s1和s2三组细胞，不同浓度TAM作用48h， T47D细胞实验组s1、s2自TAM10μM时开始，其细胞存活率明显低于对照组（scramble），且在TAM为15μM时差异最为明显（P＜0.05）；MCF-7细胞实验组s1、s2自TAM5μM时开始，其细胞存活率开始低于对照组（scramble），且在TAM为10~15μM时差异最为明显（P＜0.05）。而两实验组s1和s2之间差异无统计学意义（P＞0.05）。由此提示，下调ERβ水平可提高一定浓度TAM对乳腺癌细胞增殖的抑制性。②EdU法测定下调ERβ水平对乳腺癌细胞DNA变化EdU法检测各组乳腺癌细胞株DNA增殖情况：在不加TAM时，T47D-s1/s2两组细胞EdU标记阳性率高于T47D-scramble组；然而在15μM TAM作用48h后检测结果显示，T47D-s1/s2两组细胞EdU标记阳性率几乎为零，明显低于T47D-scramble组（P＜0.05）。MCF-7-scramble、s1和s2三组细胞比较EdU标记阳性率，得到与T47D细胞类似的结果。由此提示，下调ERβ水平一定程度上可刺激乳腺癌细胞自身增殖，但却可以增强癌细胞对TAM药物的敏感性。③流式细胞术（FCM）检测下调ERβ水平对乳腺癌细胞凋亡的影响FCM法检测各组乳腺癌细胞凋亡情况：在不加TAM时，T47D-scramble/s1/s2三组细胞的细胞凋亡无明显差异（P＞0.05）；在15μM TAM作用48h后检测结果显示，T47D-s1/s2两组细胞凋亡率明显高于T47D-scramble组（P＜0.05），两实验组间无明显差异（P＞0.05）。MCF-7-scramble、s1和s2三组细胞比较亦得到与T47D细胞类似的结果。上述结果提示，下调ERβ水平可以增强TAM药物的诱导乳腺癌细胞凋亡作用。④TUNEL法测定两株稳转细胞系各组细胞在TAM作用下细胞凋亡情况：其中T47D-s1和s2两实验组中凋亡细胞明显多于对照组，差异有显著性（P＜0.05）；而MCF-7-s2实验组中凋亡细胞数多于其他两组，其中s2组与对照组间差异有统计学意义（P＜0.05）。⑤通过western blot检测T47D-scramble/S1/S2三组细胞caspase-3及PARP的表达，TAM组中T47D-S1/S2两组活化亚基cleved-caspase-3和PARP剪切片段85KD表达明显大于对照组；而不加TAM组，三组细胞caspase-3及其活化亚基分子和PARP表达则无明显差异。结论1.雌激素受体（ER）阳性乳腺癌细胞株T47D和MCF-7，下调其ERβ基因表达量一定程度上可能刺激乳腺癌细胞本身的增殖，但却可以增强癌细胞对TAM药物的敏感性，表现为相同药物浓度作用下，他莫昔芬对细胞增殖抑制作用增强，并且可明显的诱导细胞凋亡。2.下调乳腺癌细胞ERβ基因表达水平增强癌细胞对TAM药物的敏感性，其过程可能是通过增强如caspase-3等凋亡相关分子的剪切活化作用而引起细胞凋亡来实现的。据本实验所得结果提示ERβ表达水平可能影响乳腺癌内分泌治疗效果，其高表达者可能对TAM等药物不敏感甚至可能引起对他莫昔芬治疗抵抗和耐药。