长牡蛎Crassostrea gigas是一种在潮间带营固着生活的双壳类软体动物,也是我国重要的海水养殖品种。潮间带区域的环境复杂多变,特别是潮汐的周期性涨落使长牡蛎长时间暴露于空气中。长牡蛎干露胁迫响应机制极为复杂,涉及能量代谢、免疫应答、细胞稳态和渗透压平衡等多个生命过程。然而,现有研究仅从少数分子或信号通路入手,缺乏系统性和全面性。基因加权共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)依据基因的表达谱构建相关性网络,能通过模块化、系统化分析揭示各个样本的基因表达规律,是研究干露胁迫响应等复杂生命过程的理想手段。本研究综合利用基因共表达网络分析、蛋白质互作网络、系统发生学分析等方法,分析了干露胁迫后长牡蛎鳃和闭壳肌组织的转录组数据,从能量代谢、蛋白质稳态、细胞凋亡三方面初步阐明了长牡蛎干露胁迫响应的分子机制。对干露胁迫后长牡蛎鳃和闭壳肌组织的转录组数据进行基因共表达网络分析,发现基因共聚为22个以颜色命名的模块(modules),其中red、cyan、darkgrey等在闭壳肌中具有显著表达特征的模块与长牡蛎干露胁迫应激相关。进一步分析发现,干露胁迫后5天,闭壳肌中的差异表达基因富集为“呼吸链”、“核糖体生物发生”等GO条目;干露后7天,“TRAIL激活的凋亡信号通路”、“蛋白加工的负调节”、“蛋白质磷酸化的负调节”等GO条目被富集;干露后9天,“半乳糖脂代谢过程”、“磷脂分解代谢过程”等GO条目被富集。以上结果表明:长牡蛎在干露胁迫后的短时间内(5天内)主要依赖糖原代谢维持能量供给,且干露胁迫后长牡蛎维持基础代谢的能量成本增加。随着胁迫的延续,蛋白加工和成熟的负调控以及凋亡通路被激活,表明此时长牡蛎通过减少体内的代谢活动维持生存所需的基础能量消耗。在干露胁迫后期(9-11天),长牡蛎濒临死亡,体内糖原和蛋白质消耗殆尽,依靠分解脂质维持生命。Brown模块在长牡蛎鳃组织中的基因表达水平与干露时间显著相关,对其进行KEGG富集分析发现,富集通路主要包括“内质网应激反应”、“高尔基体运输囊泡膜的内质网”、“内质网中的蛋白质加工”等,表明该模块基因主要参与内质网相关降解途径和内质网应激反应。Hub基因共表达网络的构建发现,其中心基因为STK17A,是一个能诱导凋亡通路的蛋白激酶。蛋白质互作网络及KEGG通路注释分析显示,由内质网介导的“N末端糖基化”、“内吞作用”和“内质网相关降解通路”组成蛋白互作网络,其中心基因LOC583350为E3泛素蛋白连接酶MIB2。该结果表明,brown模块是一个长牡蛎鳃细胞内质网应激相关的调控网络,一些含有锌指结构域的转录因子作为网络的调控中心发挥重要作用,内质网作为细胞压力的感受器,可以调节细胞凋亡、自噬和蛋白质降解等以维持细胞稳态。对鳃组织的转录组数据分析发现,IAP(Inhibitor of Apoptosis Protein,凋亡抑制因子)家族基因在干露胁迫后表达水平显著上升。对IAP家族基因的系统发生进行分析,发现IAP基因家族根据其结构域和系统发育上的近缘关系分为两支,其中一支为软体动物独有的进化支,而另一支为动物界普遍的进化支。牡蛎疱疹病毒OsHV-1中部分IAP与牡蛎中的IAP聚为一类,推测病毒中的IAP来源于宿主生物的基因水平转移。牡蛎IAP的非同义突变率远高于同种亚型的其他物种的IAP,这验证了了宿主基因病毒同源物的存在将产生有利于宿主中同源分子氨基酸取代的选择压力假说。上述结果表明,长牡蛎响应干露胁迫的分子机制在能量代谢、蛋白质稳态和细胞凋亡的调节上具有显著的特点。在能量代谢方面,干露胁迫的不同阶段具有不同的能量利用策略。丰富的糖原提供足够的能量来维持轻度胁迫导致的损伤,而当增长到中度压力时凋亡途径被激活,整体能量策略从积极的补偿策略变为保守的节能策略。在维持蛋白质稳态方面,作为外界环境的灵敏“感受器”,鳃细胞中的内质网可以根据环境压力的大小调整体内平衡策略,合理分配能量以满足损伤修复、转录调控和凋亡的需要。在细胞凋亡的调节方面,IAP基因家族的扩张可能发挥关键作用,而含有IAP同源物的病毒侵染可能导致IAP基因家族在牡蛎中的扩张和加速进化,这可能在牡蛎对复杂环境的适应性上发挥关键作用。本研究为后续的深入研究贝类干露胁迫适应性提供了一定的指导和借鉴意义。