目的 中药地榆始载于《神农本草经》,为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officnalisL.或长叶地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia(Bert.)Yuet Li 的干燥根,具有凉血止血,解毒敛疮的功效。在明确地榆药材抗肝肿瘤药理药效作用的基础上,针对地榆药材抗肝肿瘤药效物质基础不清楚、作用机制不明确的科学问题,采用大孔吸附树脂法及微流控芯片结合流式细胞技术,开展地榆药材抗肝癌药效物质基础及初步作用机制研究,明确地榆药材抗肿瘤的药效物质,阐述其药效物质作用于细胞的生理机制,该研究为地榆药材的抗肝肿瘤类新药研发及临床应用提供实验依据。方法 1.采用单因素考察方法,以总黄酮和总鞣质含量为评价指标,确定地榆有效组分的最佳提取方式;采用L9(34)正交试验设计,分别选取乙醇浓度、提取时间、溶剂用量及提取次数作为考察因素,对含量和出膏率进行综合评分,优选地榆有效组分的最佳提取工艺;以总黄酮和总鞣质的纯度为考察指标,通过静、动态吸附与解吸实验优化地榆有效组分的最佳纯化工艺。2.采用高效液相色谱法,进行方法学考察,建立不同产地地榆有效组分的指纹图谱,应用中药色谱指纹图谱相似度评价软件,计算其相似度;采用液质联用技术,对地榆有效组分进行化学成分表征研究,并通过文献查阅及对照品对比,分析和鉴定出地榆有效组分组成的单体成分;并在此基础上,开展基于多指标成分定量的地榆药材有效组分质量控制研究。3.使用CorelDraw软件设计一种体外抗肝肿瘤药效筛选芯片;并在此基础上,采用Hoechst 33342/碘化丙啶(PI)双染技术,开展不同产地地榆有效组分及单体成分对人肝癌细胞HepG2体外药效学研究。4.采用流式细胞仪,通过Annexin V-FITC/PI双染色法及PI单染色法,探讨地榆有效组分对人肝癌HepG2细胞周期分裂及凋亡坏死的影响;采用实时荧光定量PCR技术,基于肝癌细胞凋亡和迁移通路检测地榆有效组分作用后相关基因的相对表达量,探讨地榆抗肝肿瘤的初步作用机制。结果 1.优选出地榆黄酮的最佳提取工艺为:70%乙醇,15:1的液料比,回流提取3次,每次提取1.5h,采用此提取工艺提取,地榆黄酮含量为14.43%,RSD为1.08%;最佳纯化工艺为:采用HPD-300型号树脂,以浓度为0.1g/mL的药液,按0.4g/mL(生药量/树脂体积)比例上样,5BV、70%乙醇洗脱,收集洗脱液,采用此纯化工艺纯化,地榆黄酮纯度为 88.60%,RSD 为 0.98%,收率为 80.76%,RSD 为 0.68%。2.优选出地榆鞣质的最佳提取工艺为:60%丙酮,15:1的液料比,超声提取3次,采用此提取工艺提取,地榆鞣质含量为15.08%,RSD为1.04%;地榆鞣质的最佳纯化工艺为:采用HPD-400型号树脂,上柱液浓度为3.94mg/mL,4倍柱树脂体积上柱,用6倍柱树脂体积的70%乙醇溶液洗脱,收集第一次洗脱液,挥干后二次上柱,采用此纯化工艺纯化,地榆鞣质纯度为74.72%,RSD为0.91%。3.采用高效液相色谱法,构建6个不同产地地榆有效组分的指纹图谱,其中黄酮类组分确定12个共有峰,6个批次样品相似度均大于0.88;其中鞣质类组分确定15个共有峰,8个批次样品相似度均大于0.94。同时表征出地榆有效组分中5种化学成分,黄酮成分为山奈苷、槲皮素,地榆鞣质成分为没食子酸、儿茶素、阿魏酸。同时对6个不同产地地榆含量进行检测,其中安徽地榆中山奈苷含量最高为0.0368mg/g,黑龙江地榆中槲皮素含量最高为0.0693mg/g,河南地榆中没食子酸含量最高为0.5977mg/g、甘肃地榆中儿茶素含量最高为0.7549mg/g,甘肃地榆中阿魏酸含量最高为0.5137mg/g。4.设计并制作了一种用于肝肿瘤细胞同时在线筛选的双层PDMS微流控芯片;在第一 PDMS薄膜层上设有16(A-H)个气动微阀,两两配对使用控制通道的闭合,并设有相互对称的8条液阀,可实现不同通道中不同种类不同浓度的药液配给;第二PDMS薄膜层上设有16条椭圆形结构的细胞培养腔室和流体通道。该芯片可实现对于人肝癌HepG2细胞的不同药效组分及单体成分同时筛选。5.对不同产地地榆有效组分和单体成分开展基于人肝癌细胞HepG2的体外药效实验,结果显示:不同地榆总黄酮、总鞣质和单体成分槲皮素、没食子酸对人肝癌HepG2细胞均具有一定抑制作用,其中地榆总黄酮凋亡坏死率在15.89%-26.38%,总鞣质凋亡坏死率在62.34%-90.52%,地榆鞣质药效优于地榆黄酮,黄酮类中黑龙江产地药效最好,鞣质类中山东产地药效最好。6.地榆鞣质不同剂量、地榆黄酮不同剂量均有诱导肝癌细胞凋亡及周期阻滞的作用,其中地榆鞣质高剂量组给药刺激36h后凋亡坏死率可达到(86.0±0.2)%,其中地榆黄酮高剂量组给药刺激36h后凋亡坏死率可达到(24.3±0.3)%。实时荧光定量PC R检测结果分析可知,地榆总黄酮和总鞣质均可以增加肝癌HepG2细胞中Bax、Caspas e-3mRNA的表达,降低Bcl-2mRNA的表达,且总鞣质的效果更为显著。结论 1.筛选出的地榆黄酮、鞣质类成分提取、纯化工艺稳定性,且纯度较高,可以为地榆抗肝肿瘤作用机制研究奠定前期基础。2.采用高效液相色谱法建立了 6个不同产地地榆黄酮类、8个不同产地地榆鞣质类成分指纹图谱,对指纹图谱中成分进行了表征,同时围绕解析出来的5种成分开展基于多指标成分定量分析,该研究为地榆药材的品质评价和质量控制提供实验基础。3.设计、制作作用于地榆有效组分抗肝肿瘤作用的药效筛选芯片,同时完成了不同产地地榆有效组分及单体成分的体外药效筛选研究。研究结果证明地榆总黄酮、总鞣质都具有一定的体外抗肝肿瘤的作用,其中不同浓度下的没食子酸细胞凋亡率与总鞣质细胞凋亡率差别不大,推测没食子酸可能是地榆鞣质发挥抗肝肿瘤作用的主要单体成分;其中不同产地地榆药材有效组分之间体外抗肝肿瘤存在一定差异性,其原因可能是由于不同产地之间气候环境差异导致所含化学成分含量不同,该研究为下一步开展不同产地地榆抗肝肿瘤作用机制研究提供了重要的前期基础。4.证明地榆黄酮、鞣质类均能够诱导肝癌HepG2细胞凋亡,但其作用点有所不同,地榆总鞣质能通过延长S期细胞比例,抑制其DNA的合成以及细胞的分裂从而抑制肺癌细胞的增殖,且随着剂量的增加,对肝癌细胞S期抑制程度呈一定的依赖性。地榆总黄酮能通过延长S期及G2/M期细胞比例,抑制其DNA的合成以及细胞的分裂从而抑制肺癌细胞的增殖,其作用可能是调控上游信号Bcl-2和Bax的表达,激活执行凋亡功能的caspase3,从而促进了肝癌细胞的凋亡,该研究明确了地榆有效组分体外抗肝肿瘤的初步作用机制,为阐述地榆抗肿瘤提供实验依据和理论基础。