研究背景:随着全球化进程的发展,世界各地的病原相互传播扩散,造成动物大量发生各种病原的混合感染,对农业生产的发展造成很大影响。随着混合感染的情况逐渐复杂化,患病动物可能同时感染多种症状相似的病原,现有的常规检测手段耗时耗力,多重PCR检测技术作为现有的常规检测方法中通量最大的检测方法,最多可以同时检测四种病原,难以涵盖所有可能存在的致病病原,因此开发一种大通量核酸检测技术显得尤为重要。目的:本研究旨在利用分子信标的高度特异性,结合桥式扩增在扩增产物上引入标签的方法,开发一种基于探针熔解曲线的大通量核酸检测技术。方法:通过自主设计一组Tm值差异在5℃以上的标签和分子信标序列,作为单通道多重检测的标签和分子信标。根据NCBI Nucleotide公布的各病原核酸序列,设计各病原特异性引物,通过在上游引物5’端前增加一段碱基序列的方式,将标签互补序列引入扩增完成的核酸序列中,以标签的同源分子信标作为探针,检测标签互补序列。根据熔解曲线分析的结果中,熔解曲线峰对应的Tm值来确定样品中病原的种类。利用改良分子信标的高度特异性,在已设计完成的标签和分子信标的基础上,通过A/T、C/G单个或多个碱基的互换,得到新的标签和分子信标,作为其他通道的标签和分子信标。碱基替换后的分子信标Tm值无明显变化。本研究以TGEV、PEDV、CSFV、ASFV、通用型FMDV、猪RVs、高致病性PRRSV、PCV2为例对该方法进行验证。结果:（1）基于分子信标熔解曲线差异实现单通道多重检测:通过设置不同Tm值的标签序列,实现了FAM通道内多重检测的目的。（2）基于分子信标熔解曲线的二维PCR检测技术:本研究建立了可用于双色荧光通道的标签和探针序列库,成功应用二维PCR检测出猪RVs、高致病性PRRSV和PCV2等八个靶标。（3）重要动物病原二维PCR检测技术的应用与评价:与特异性引物相同的探针法荧光定量PCR进行敏感性试验显示,两种方法间无明显差异。对临床样本的检测一致性分析显示,两种方法的kappa系数为0.98,大于0.75,所以两种检测方法高度一致。结论:分子信标结合标签的二维PCR技术与探针法荧光定量PCR的一致性良好,适用于大通量多靶标的检测,适用于多种病原混合感染的检测、病原微生物的分型及多种耐药菌的鉴别。