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目的1.探讨下调Rictor表达后食管鳞癌细胞对PI3K抑制剂LY294002敏感性变化及分子机制。2.探讨SGK3的表达水平与食管鳞癌细胞对Akt抑制剂MK2206敏感性关系及机制。方法一、体外下调Rictor表达增强食管鳞癌细胞对LY294002敏感性的分子机制。1.采用CCK-8法检测LY294002对食管鳞癌细胞增殖的影响,Western blot法检测LY294002对PI3K/Akt/m TOR通路相关蛋白表达的影响。2.前期实验结果表明体外下调Rictor表达增强食管鳞癌细胞对LY294002敏感性,本研究中采用Western blot检测下调Rictor表达前后PI3K/Akt/m TOR通路相关蛋白表达的变化。二、下调Rictor表达对LY294002抗食管鳞癌作用的影响及分子机制。1.用ECa109-Rictor-sh RNA和ECa109-control-sh RNA细胞建立裸鼠移植瘤模型,然后用LY294002开始治疗,检测LY294002对不同Rictor水平肿瘤生长的影响,再通过H&E染色和TUNEL法检测体内细胞凋亡的情况。2.提取食管鳞癌组织蛋白,采用Western blot检测裸鼠移植瘤中PI3K/Akt/m TOR通路相关蛋白的表达。三、长时间应用MK2206对食管鳞癌细胞增殖的影响及分子机制。1.MK2206处理食管鳞癌细胞ECa109和EC9706 24 h或48 h,CCK-8检测MK2206对食管鳞癌细胞增殖的影响。2.提取ECa109、EC9706、KYSE70、TE-1和KYSE140食管鳞癌细胞的总蛋白,Western blot检测不同食管鳞癌细胞株SGK3蛋白的表达。3.2μM的MK2206处理ECa109和EC9706细胞0 h,3 h,1 d,3 d和5 d,提取细胞总蛋白,Western blot检测细胞中Akt和SGK3蛋白表达和活性的变化情况。四、下调SGK3表达后食管鳞癌细胞对MK2206敏感性的变化及分子机制。1.三种携带SGK3-sh RNA的慢病毒载体转染食管鳞癌细胞ECa109和EC9706并用嘌呤霉素筛选稳定表达ECa109-LV3-SGK3和EC9706-LV3-SGK3细胞株,Western blot检测转染效率。2.利用筛选出的下调效率最高的细胞株,通过CCK-8、细胞克隆形成、流式细胞术、细胞划痕等方法探讨下调SGK3的表达后食管鳞癌细胞对Akt抑制剂MK2206敏感性的变化。3.将筛选后的细胞株用MK2206处理0 h,3 h,1 d,3 d和5 d,采用Western blot方法检测下调食管鳞癌中SGK3的表达水平后不同给药时间Akt和SGK3蛋白表达及活性的变化。结果一、体外下调Rictor表达通过削弱LY294002对Akt/PRAS40通路的激活增强食管鳞癌细胞对LY294002的敏感性。1.LY294002抑制食管鳞癌细胞ECa109和EC9706的增殖。LY294002对ECa109和EC9706两株细胞作用24 h的IC50分别为:45.62±3.2μM和48.03±1.68μM,作用48 h的IC50分别为:19.17±3.14μM和16.47±1.22μM。2.LY294002抑制食管鳞癌细胞PI3K/Akt/m TOR通路。LY294002以剂量和时间依赖性的方式抑制PI3Kp85α,p-Akt(Thr308)和p-p70S6K(Thr389)的表达,却促进了p-Akt(Ser473)和p-PRAS40(Thr246)的表达。3.体外下调Rictor的表达后削弱了Akt/PRAS40通路的激活。Western blot证实Rictor-sh RNA下调了细胞中Rictor的表达,机制探讨发现,下调Rictor表达增强了LY294002对PI3K/Akt/m TOR通路的抑制作用,且抵消了其对Akt/PRAS40通路的激活作用。二、下调Rictor表达增强了LY294002对食管鳞癌肿瘤生长的抑制作用。1.下调Rictor表达增强了LY294002抑制肿瘤生长抑制及诱导凋亡的作用。裸鼠移植瘤实验证实,LY294002可抑制肿瘤生长,下调Rictor表达增强了LY294002对肿瘤的抑制作用;H&E染色和TUNEL结果显示下调Rictor与单独给药LY294002均能体内诱导食管鳞癌细胞凋亡,但下调Rictor后LY294002对细胞凋亡的诱导作用更强。2.体内下调Rictor的表达后削弱了Akt/PRAS40通路的激活。体内机制与体外一致,下调Rictor表达增强了LY294002对PI3K/Akt/m TOR通路的抑制作用,且抵消了其对Akt/PRAS40通路的激活作用。三、MK2206长时间作用食管鳞癌细胞使Akt活性降低但促进SGK3蛋白表达。1.MK2206抑制食管鳞癌细胞ECa109和EC9706的增殖。SGK3在五株食管鳞癌细胞中均有表达且存在差异,在ECa109、EC9706和KYSE70表达水平较低,在TE-1和KYSE140表达水平较高,MK2206对两株细胞作用24 h的IC50分别为25.37±1.40μM和25.58±1.41μM,作用48 h的IC50为11.25±1.05μM和14.15±1.15μM。2.MK2206长时间抑制Akt的活性的同时促进SGK3蛋白的表达。当用MK2206处理食管鳞癌细胞不同的时间时,随着给药时间的延长,p-Akt(Ser473),p-Akt(Thr308)和p-PRAS40(Thr246)的表达水平降低,但p-p70S6K(Thr389),SGK3和p-SGK3(Thr320)的表达水平升高。四、下调SGK3的表达通过抑制MK2206对SGK3的代偿性激活增强食管鳞癌细胞对MK2206的敏感性。1.下调SGK3的表达可增强食管鳞癌细胞对MK2206的敏感性。ECa109-LV3-SGK3-home-1077和EC9706-LV3-SGK3-home-1071对SGK3敲除效果最好;下调SGK3表达后,MK2206使食管鳞癌G1和G2期细胞数目均增加,同时MK2206抑制食管鳞癌细胞增殖、克隆形成、细胞迁移的效果更加明显。2.下调SGK3表达后MK2206长时间作用可同时抑制Akt和SGK3的活性。随着MK2206作用时间的延长,p-Akt(Ser473),p-Akt(Thr308),p-PRAS40(Thr246)和p-p70S6K(Thr389)的表达水平降低,SGK3及p-SGK3(Thr320)的表达也降低。结论1.下调Rictor增强了食管鳞癌细胞对LY294002的敏感性,其机制与下调Rictor逆转LY294002诱导的Akt/PRAS40通路激活有关。2.MK2206长时间作用抑制食管鳞癌中Akt活性但使SGK3的表达升高,下调SGK3增强了食管鳞癌细胞对MK2206的敏感性,其机制与下调SGK3抑制了MK2206对SGK3的代偿性激活有关。